藥物中苯胺類基因毒性雜質檢測方法研究進展*

鄧鳴，朱健萍，盧日剛

（廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

苯胺類化合物是重要的化工原料，也是活性藥物合成的中間體或降解產物。N-羥基苯胺類、N-?；被?、苯胺和烷基取代的苯胺均為能與脫氧核糖核酸（DNA）發生反應的警示結構［1-3］，可能具有致癌性和致突變性。很多情況下，苯胺與化學基團偶聯使得其基因毒性不易顯現，但仍需監控含苯胺結構的化合物，以評價化合物本身或其中間體、合成副產物或降解雜質等的風險。由于藥物中苯胺類雜質要求的限度較低，故要求檢測方法專屬性強且靈敏度很高，現行測定方法有氣相色譜（GC）法、液相色譜法等，而色譜與質譜聯用法在定性、定量方面比其他分析方法更優越，應用更廣泛。在此，檢索中國知網和Sci-Hub數據庫藥物中苯胺類基因毒性雜質檢測方法的相關文獻（檢索時限為自建庫起至2021年12月15日），分析不同檢測方法的適用性和優劣，并對其發展趨勢提出相應觀點。

1 GC法

該法優點為分離效能好、靈敏度高、選擇性強、分析速度快等，適用于揮發性有機化合物的定性、定量分析。芳香胺類化合物屬極性半揮發性有機物，可采用GC法檢測，但大部分苯胺類雜質的揮發性不強，導致檢測的靈敏度較低。GC法適用于熱穩定物質，如樣品主成分為熱不穩定物質，高溫降解產物會影響雜質檢測的專屬性。

張雪玲等［4］采用該法測定美沙拉嗪緩釋顆粒中苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚的含量，結果3種雜質與主峰分離度良好，回收率為98.04%～103.00%，檢測限均為0.015μg/mL。王春霞等［5］采用該法測定鹽酸利多卡因注射液中2，6-二甲基苯胺、單乙基甘氨酰胺二甲苯、甘氨酰二甲苯胺的含量，利用HP-1毛細管色譜柱可完全分離上述3種雜質，方法專屬性好，結果準確可靠。為降低主成分濃度過高導致的干擾，范婧等［6］采用液液萃取法提取托拉塞米原料中的基因毒性雜質鄰硝基甲苯、鄰甲苯胺、對甲苯胺、間甲苯胺，并采用氣相色譜質譜聯用（GC-MS）法進行含量測定；考察了正庚烷、正己烷、二氯甲烷作為提取溶劑時的回收率，結果二氯甲烷萃取能力最佳，4種雜質的加樣回收率為80%～115%，定量限為0.3～0.5μg/g。李靖坤等［7］采用GC-MS法檢測吉非替尼中3，4-二氯苯胺，利用多反應監測（MRM）掃描模式，有效降低了基質效應，3，4-二氯苯胺質量濃度線性范圍為1～100 ng/mL，回收率為92.53%～118.15%，檢測限達1μg/mL。

2 高效液相色譜（HPLC）法

該法通過各種色譜柱技術及聯用技術，能實現絕大多數化合物的分離、分析，彌補了GC法難以分析強極性、熱不穩定、難揮發化合物的不足，是目前苯胺類基因毒性雜質檢測最常用的色譜方法。

2，6-二甲基苯胺為利多卡因中的常見雜質，BEBAWY等［8］采用高效液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）法測定了口腔凝膠中鹽酸氨基吖啶、鹽酸利多卡因及雜質2，6-二甲基苯胺的含量，結果雜質與主成分分離良好，2，6-二甲基苯胺檢測限為0.26μg/mL，可滿足常規分析需要。萬紅艷［9］采用HPLC-UV法分析了利多卡因貼片的有關物質，結果利多卡因與2，6-二甲基苯胺等雜質分離度良好，雜質檢測限達0.001μg/mL。分散液液微萃取法因操作簡便、快速，有機溶劑消耗少，萃取富集效果好等優點受到分析領域的廣泛關注。王璇璇等［10］建立了基于六氟異丙醇（HFIP）-正辛醇超分子溶劑的分散液液微萃取以萃取富集鹽酸利多卡因注射液中的2，6-二甲基苯胺，可實現高效萃取和富集，方法簡單、快速；采用HPLC-UV法檢測2，6-二甲基苯胺含量，準確度和精密度良好，檢測限達0.33 ng/mL。蒲小琴等［11］采用HPLC-UV法測定鹽酸瑞伐拉贊中4-羥基-2-（4-氟苯胺）-5，6-二甲基嘧啶等雜質含量，方法靈敏度高、專屬性強、準確度高，能快速同時測定鹽酸瑞伐拉贊中已知雜質及未知雜質，滿足質控要求。涂佳楠等［12］采用HPLC-UV法測定鋁鎂加混懸液中抑菌劑醋酸氯己定及其降解雜質對氯苯胺的含量，選擇離心并超聲提取的前處理方法，有效降低了主成分的干擾，對氯苯胺的檢測限為0.001 2μg/mL。HUANG等［13］在利拉利汀強酸破壞試驗中發現了未知雜質Ⅰ，通過質譜、核磁共振譜、紅外光譜等檢測方法確定了該雜質含有N-酰化氨基芳基警示結構；后采用超高效液相色譜法有效分離了主峰與各雜質峰，采集時間僅需9 min且檢測靈敏度提高，定量限達60μg/g，可滿足檢測需要。趙國敏等［14］采用二正丁胺為柱前衍生劑，與主成分4-氯-3-（三氟甲基）苯異氰酸酯生成穩定的衍生物，從而建立了測定其雜質CTF-苯胺和CTF-脲含量的HPLC-UV法，方法專屬性好、簡便易行。

反相色譜除常用C18柱外，其他色譜柱如苯基柱可以提供π-π作用，用于含有苯環或能提供π鍵作用的結構類似物分析；而五氟苯基（PFP）柱除可提供π-π作用外，還可提供偶極作用、靜電作用等，提高了苯環上位置異構體的分辨能力［15］。徐潔［16］比較了不同官能團液相色譜柱對利伐沙班和潛在基因毒性雜質4-（4-氨基苯基）-3-嗎啉酮的分離效果，發現苯基硅烷鍵合柱對分離度改善作用明顯，推測原因為苯基固定相與不飽和分析物間存在特殊的π-π作用，較C18填料選擇性高，此外，該方法下該雜質檢測限為5μg/g，遠低于其限度（50μg/g）。王潔等［17］建立了同時檢測3-氯-4-氟苯胺（醫藥工業中常見的重要中間體）及其5個具有苯胺結構有關物質的HPLC法。由于主成分及其雜質僅為苯環上化合物間取代基位置及個數的微小差異，傳統C18柱無法區分。經篩選，Thermo Hypersil GOLD PFP柱對該品種的選擇性較高，且雜質和主峰的分離度和峰形最好。

陳鑒東等［18］采用熒光胺作為衍生劑，建立了同時檢測對甲苯磺酸拉帕替尼中的雜質3-氯-4-（3-氟苯基甲氧基）苯胺的高效液相色譜-熒光檢測（HPLC-FLD）法。熒光胺可使具有伯胺結構的雜質被衍生化，而主成分甲苯磺酸拉帕替尼為芳仲胺結構，不參與反應，故不干擾測定。該方法相比于UV法，靈敏度大幅提高，檢測限達1μg/g。

高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）法有更高的靈敏度和更強的專屬性，是目前檢測芳香胺類化合物的另一種重要方法。張云峰等［19］建立了測定氟胞嘧啶中痕量基因毒性雜質N，N-二甲基苯胺含量的HPLC-MS法，定量限達0.04μg/g。該雜質限度為0.25μg/g，而HPLC-UV法的定量限為200μg/g，遠達不到要求。

張莉等［20］建立了分析甲苯磺酸拉帕替尼中痕量基因毒性雜質4-（3-氟苯甲氧基）-3-氯苯胺（為合成甲苯磺酸拉帕替尼起始原料的中間體，也是其降解產物）的HPLC-MS法，方法檢測限為0.036 ng/mg，定量限為0.107 ng/mg，可滿足雜質測定的要求。王秀珍等［21］則采用LC-MS/MS法檢測該遺傳毒性雜質，方法的定量限為0.01 ng/mg、檢測限為0.004 ng/mg，供試品溶液采用四氫呋喃配制，室溫條件下8 h內基本穩定。

王珊珊等［22］采用HPLC-MS/MS法分析吉非替尼中痕量基因毒性雜質3，4-二氟苯胺和4-氯-3-氟苯胺（均為合成吉非替尼原料的副產物），該方法專屬性強，靈敏度高，定量限均為0.5 ng/mg。孫春艷等［23］同法測定吉非替尼中3-氯-4-氟苯胺、3，4-二氟苯胺、3-氟-4-氯苯胺和3，4-二氯苯胺4種基因毒性雜質，該方法在特異性、線性范圍、精密度、準確性、穩定性和耐用性方面得到了驗證。4種雜質的定量限均在0.12～1.2μg/g之間。

宋凡等［24］采用LC-MS/MS法同時測定酒石酸伐尼克蘭中6個具有潛在基因毒性類苯胺雜質的含量。由于類苯胺化合物極易氧化降解，研究采用二巰基蘇糖醇為抗氧化穩定劑，并用1%氨水調pH至7.0，提高了供試品溶液的穩定性。該方法專屬性好，靈敏度高，選擇性強，定量限約為1 ng/mg，符合測定靈敏度要求。

梁鍵謀等［25］建立了測定富馬酸喹硫平中合成原料N，N-二甲基苯胺含量的LC-MS/MS法，定量限為0.02 ng/mg，低于限度（0.06 ng/mg）。REDDY等［26］建立了檢測雷貝拉唑中苯二胺、4-硝基二甲基吡啶-N-氧化物和芐基三乙基氯化銨這3個具有基因毒性前體化合物的LC-MS法。該方法具有良好的線性范圍、特異性、準確性、精確度和穩定性，定量限均低于1.8μg/g，符合測定靈敏度要求。冼芷然等［27］采用LC-MS/MS法檢測利多卡因原料和注射液中2，6-二甲基苯胺和潛在遺傳毒性雜質N-氯乙酰-2，6-二甲基苯胺，并指出這2個雜質除由原料引入外，可能分別由氧化或堿性條件下降解引入，為鹽酸利多卡因注射液的遺傳毒性風險評估和工藝優化提供了參考與指導。王慶鵬等［28］建立了測定替格瑞洛中基因毒性雜質N，N-二乙基苯胺含量的LC-MS/MS法，方法簡便、準確可靠，檢測限為0.06 ng/mL，定量限為0.2 ng/mL。

3 總結與展望

藥品中的雜質通常被定義為“影響藥物純度的物質”，按其來源可分為工藝雜質（合成起始物、中間體、試劑、溶劑、副產物等）和降解雜質［29］。藥品中的雜質一般無治療作用，可能有副作用，甚至具有毒性。其中基因毒性雜質可直接或間接損傷細胞DNA，產生基因突變或誘變，或導致癌癥，其特殊性引起人們的廣泛關注［30］。近年來歐洲藥物評審組織（EMEA）、美國食品和藥物管理局（FDA）、國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）等機構或組織相繼發布了針對基因毒性雜質的指導原則［31-33］，這些原則將“警示結構”作為區分普通雜質和潛在基因毒性雜質的標志；對于含有警示結構的雜質，應進行（定量）構-效關系評估和體內外基因突變研究，或將雜質水平控制在毒理學關注閾之下。警示結構是指與致突變性相關的化學基團或分子（亞）結構，雖然具有警示結構的化合物不一定具有遺傳毒性或致癌性，但提供了遺傳毒性存在的可能性，為藥物研發和藥物安全評價提供了指導。

近年來，藥品監管部門與藥物研發機構愈發重視藥物中的基因毒性雜質，由于該類雜質相對主成分屬痕量物質，方法的靈敏度和專屬性尤為重要。GC法靈敏度高、選擇性強、分析速度快，適用于對熱穩定且具有揮發性的苯胺類化合物。LC法準確度和精密度較高，適用范圍廣，但普通的C18柱對某些結構極類似的化合物分離效果較差，可采用特殊的填料如苯基柱、五氟苯基柱彌補分離效能的不足。HPLC-FLD法相對HPLCUV法有更高的靈敏度和良好的選擇性，適用于可發射熒光或衍生化后能發射熒光的物質。GC-MS法和HPLC-MS法專屬性強，靈敏度高，可有效降低基質干擾，避免假陽性，已逐漸成為主流檢測方法。

目前，大多數苯胺類雜質的檢驗方法均采用溶劑溶解樣品后直接進樣，主成分和輔料等基質的存在對色譜系統損害嚴重，影響了方法的穩定性和準確度。因此，建立合適的前處理方法，在除去基質的同時富集被測物，是苯胺類雜質研究的發展方向。目前已有分散液液微萃取法、固相萃取法［34-35］等前處理方法成功運用于藥物雜質的檢測中。本文中重點介紹了藥品中苯胺類基因毒性雜質的分析方法，隨著新的檢測技術和分析儀器的出現，未來該類雜質的分析方法必將向專屬性更強、靈敏度更高、準確度更好的方向發展。