氣相色譜法測定枇杷止咳顆粒中薄荷腦含量*

李靖云，孫輝，曾蒲軍，王銀紅△

（1.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，湖南 長沙 410001；2.湖南省藥品質(zhì)量評價工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410001；3.湖南省藥品審核查驗(yàn)中心，湖南 長沙 410001）

枇杷止咳顆粒由枇杷葉、罌粟殼、百部、白前、桑白皮、桔梗、薄荷腦組成，可用于止嗽化痰及治療痰熱壅肺所致咳嗽、咯痰及支氣管炎見上述癥候者，方中薄荷腦為佐藥，具有祛風(fēng)利咽功效。2020年版《中國藥典（一部）》［1］收載的該制劑質(zhì)檢方法為薄層色譜（TLC）法。研究顯示，氣相色譜（GC）法常用于其含量測定［2-5］?？紤]到制劑中薄荷腦的制備工藝（用少量乙醇溶解后噴入，混勻，制粒）及其揮發(fā)性，TLC法不能全面反映藥品中薄荷腦的實(shí)際質(zhì)量可能存在較大誤差［6-7］，為此，本研究中采用GC測定不同企業(yè)枇杷止咳顆粒中薄荷腦含量，為優(yōu)化薄荷腦的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 8890型氣相色譜系統(tǒng)、氫火焰離子化（FID）檢測器（安捷倫科技有限公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mettler AE240型、Mettler Toledo XSE 205DU型電子分析天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］。

1.2 試藥

枇杷止咳顆粒（企業(yè)A，批號記為S1，S2；企業(yè)B，批號記為S3，S4；企業(yè)C，批號記為S5，S6；企業(yè)D，批號記為S7，S8；企業(yè)E，批號記為S9）。薄荷腦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110728-201707，含量99.8%）；萘對照品（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號為20190811）；無水乙醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25μm）；載氣：高純度氮?dú)猓恢鶞兀?20℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測器：FID；檢測器溫度：250℃；空氣流速：400 mL/min；氫氣流速：30 mL/min；流速：3 mL/min；分流比：10∶1；進(jìn)樣量：1μL。

2.2 溶液制備

內(nèi)標(biāo)溶液：取萘對照品52.98 mg，精密稱定，置500 mL容量瓶中，加入無水乙醇溶解，定容，搖勻，即得。

對照品溶液：取薄荷腦對照品52.45 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入無水乙醇溶解，定容，搖勻，即得對照品溶液Ⅰ；精密量取10 mL，置50 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容，搖勻，精密量取25 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，加入無水乙醇振搖溶解，定容，搖勻，即得對照品溶液Ⅱ。精密量取對照品溶液Ⅰ2 mL，置100 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻，精密量取20 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液20 mL，置200 mL容量瓶中，加入無水乙醇溶解、定容，即得對照品溶液Ⅲ。

供試品溶液：取樣品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入含2 mL內(nèi)標(biāo)溶液的無水乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，冰浴超聲（功率500 W，頻率40 kHz；下同）處理20 min，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，加無水乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按枇杷止咳顆粒處方及工藝制備缺薄荷腦的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對照品溶液Ⅱ、供試品溶液和陰性對照品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果薄荷腦與其他物質(zhì)均能達(dá)到基線分離，理論板數(shù)按薄荷腦峰計(jì)應(yīng)不低于10 000，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 氣相色譜圖1.Menthol 2.NaphthaleneA.Reference solutionⅡB.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 GC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取0.01，0.05，0.20，0.50，1.00，2.00 mL對照品溶液Ⅰ，及內(nèi)標(biāo)溶液1 mL共6份，置10 mL容量瓶中，加入無水乙醇溶解、定容、搖勻，制成質(zhì)量濃度分別1.05×10-3，5.23×10-3，2.09×10-2，5.23×10-2，0.105，0.209 mg/mL的系列對照品溶液；分別取1μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以薄荷腦質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、對照品峰面積/萘峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=7.626 8X+0.002 4（R2=1）。結(jié)果表明，薄荷腦質(zhì)量濃度在1.05×10-3～0.209 mg/mL范圍內(nèi)與對照品峰面積/萘峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對照品溶液Ⅱ適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄相對響應(yīng)值。結(jié)果薄荷腦峰面積的RSD為0.51%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品適量，精密稱定，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄相對響應(yīng)值并計(jì)算含量。結(jié)果薄荷腦平均含量為0.083 mg/g，RSD為0.98%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，6，12，18，24 h時，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄相對響應(yīng)值。結(jié)果薄荷腦峰面積的RSD為0.68%（n=5），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取1.5 g，精密稱定，共6份，各加入20 mL 2.2項(xiàng)下對照品溶液Ⅲ，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄相對響應(yīng)值并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取5家企業(yè)9批樣品各適量，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄相對響應(yīng)值并計(jì)算薄荷腦含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg/袋，n=2）Tab.2 Results of the content determination of menthol in the samples（mg/bag，n=2）

3 討論

3.1 試驗(yàn)條件考察

薄荷腦為易揮發(fā)物質(zhì)，故提取時不考慮因溫度過高而易造成損失的索式提取、回流提取等方法，而選擇冰浴超聲提取方法。超聲時間分別考察10，20，30 min，結(jié)果表明，超聲10 min提取基本完全，故選擇中間值20 min作為提取時間。提取溶劑比較了石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯和無水乙醇，以無水乙醇的提取率最高，故選擇。同時對提取體積（10，15，20 mL）進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，取樣品細(xì)粉約3 g時，10 mL與20 mL的提取率基本相當(dāng)，為保證提取完全，提取體積選擇20 mL。

3.2 樣品含量測定結(jié)果分析

本研究結(jié)果表明，同一企業(yè)（即使不同批次）樣品含量差異較小，不同企業(yè)之間差異較大（最高含量約為最低含量的2倍）?？紤]到薄荷腦具揮發(fā)性、沸點(diǎn)低、室溫易升華的特點(diǎn)，其可能吸附在包裝袋內(nèi)表面［8］。按本研究中擬訂方法和色譜條件，隨機(jī)抽取各企業(yè)各批樣品，均6袋，分別對包裝袋上及樣品內(nèi)容物中的薄荷腦含量進(jìn)行考察。根據(jù)吸附量可將企業(yè)分為3類。Ⅰ類，企業(yè)C，D；Ⅱ類，企業(yè)A，B；Ⅲ類，企業(yè)E；薄荷腦吸附量分別為＜10%，20%～30%，≈50%。

3.3 方法評價

本研究中所建方法簡單可行、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠，可用于測定枇杷止咳顆粒中薄荷腦含量。但發(fā)現(xiàn)顆粒劑的包裝袋上會吸附薄荷腦。查看各生產(chǎn)企業(yè)的包裝均為復(fù)合膜，包裝材料無明顯差異，推測可能是由于薄荷腦的噴入工藝導(dǎo)致其包裹于顆粒表面，在儲存過程中揮發(fā)后吸附于包裝袋上［8-9］，從而導(dǎo)致顆粒中薄荷腦含量減少。建議生產(chǎn)企業(yè)考察藥用包裝袋對薄荷腦的吸附作用，通過改良生產(chǎn)工藝，改善儲存溫濕度或更換吸附性較小的包裝材料等方式，減少薄荷腦的損失。