白及多糖聯(lián)合5-氟尿嘧啶對人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

溫艷，張強(qiáng)，曹涵博△

（1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065；2.陜西省藥品疫苗檢查中心，陜西 西安 710065）

肝癌是我國較常見及高發(fā)腫瘤［1］。化學(xué)合成藥物對其療效良好，但不良反應(yīng)較明顯；傳統(tǒng)中藥因其療效較好和不良反應(yīng)較少的優(yōu)點(diǎn)在治療癌癥方面具有一定優(yōu)勢［2］。白及為我國傳統(tǒng)中藥，是蘭科植物白及的干燥塊莖，藥用歷史悠久、價(jià)值高，有止血、收斂、生肌、消腫等功效，主要化學(xué)成分包括聯(lián)芐類、菲類、二氫菲類、萜類化合物等［3］。白及多糖（BSP）為從中藥白及中提取獲得的甘葡聚糖，藥理學(xué)研究結(jié)果表明具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有較高價(jià)值［4-5］。5-氟尿嘧啶（5-FU）是目前常用于胃癌、食管癌、腸癌等癌癥的治療［6］。細(xì)胞凋亡受多基因的嚴(yán)格控制，如B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）家族，半胱氨酸蛋白水解酶（Caspase）家族、原癌基因C-myc等［7］。有研究報(bào)道多糖對化學(xué)藥物治療（簡稱化療）藥物有增效作用［8］。本研究中選取合適質(zhì)量濃度的BSP，聯(lián)合5-FU作用于體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株，并對其進(jìn)行活力檢測，分析作用后凋亡相關(guān)蛋白基因及蛋白表達(dá)的變化，為BSP抗肝癌的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥及細(xì)胞

儀器：DNM-9606型酶聯(lián)免疫檢測儀（德國Thermo公司）；MA-6000型實(shí)時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；Tanon 5200型化學(xué)發(fā)光儀（賽默飛世爾科技公司）；Attune Nxt型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；SHB-1600A2型生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備儀器廠）。

試藥：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone公司，批號分別為AG29719232，AF29548181）；青霉素-鏈霉素（美國Gibco公司，批號為171334）；BSP（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，以生理鹽水溶解）；5-FU（美國MCE公司，批號為HY-90006）；CCK-8試劑（美國Sigma公司，批號為91963）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號為CA1050）；Caspase-8、B淋巴Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白（BAX）、GAPDH、山羊抗兔IgG（H+L）、山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體（英 國Abcam公司，批號分別為ab32397，ab32124，ab32503，ab8245，b205718，ab205719）。

細(xì)胞：人肝癌HepG2細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 方法

細(xì)胞活力：采用CCK-8法。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，接種于96孔板，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，加入不同質(zhì)量濃度（50，100，200，400，800μg/mL）的BSP，另設(shè)空白對照（等體積生理鹽水）。每孔加入培養(yǎng)基100μL，每組設(shè)5個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24，48，72 h后加入CCK-8試劑10μL，37℃反應(yīng)30 min，以酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度（OD）值。另設(shè)對照組（等體積生理鹽水）、BSP組（400μg/mL）、5-FU組（0.02 mol/L）、BSP+5-FU組（400μg/mL+0.02 mol/L），培養(yǎng)細(xì)胞48 h，同法操作。

細(xì)胞凋亡：采用流式細(xì)胞術(shù)。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，接種于24孔板，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，同“細(xì)胞活力”項(xiàng)分組，分別進(jìn)行相應(yīng)處理48 h，用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒嚴(yán)格按說明書進(jìn)行染色，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

Caspase-8，BAX，Bcl-2 mRNA表達(dá)：采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。將HepG2細(xì)胞接種于6孔板處理48 h，加入Trizol裂解液，再加入氯仿200μL，4℃下12 000g離心15 min，加入等體積異丙醇，4℃下12 000g離心10 min，按Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94℃，5 min；94℃40 s，56℃50 s，72℃10 min，45個循環(huán)；72℃10 min。在引物由上海金唯智公司合成，定量PCR結(jié)果通過2-ΔΔCt計(jì)算，以GAPDH為內(nèi)參，各組設(shè)3個復(fù)孔。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

Caspase-8，BAX，Bcl-2蛋白表達(dá)：采用Western blot法。將細(xì)胞接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按“細(xì)胞凋亡”項(xiàng)下分組分別處理48 h，加入細(xì)胞裂解液，測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過夜，洗脫，二抗室溫孵育1 h，洗脫。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯影，成像，目的條帶與內(nèi)參（GAPDH）條帶灰度比值為各目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均以X±s表示，行獨(dú)立樣本或配對樣本t檢驗(yàn)，以及單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量濃度BSP對細(xì)胞活力的影響

結(jié)果見圖1。處理細(xì)胞24 h后，質(zhì)量濃度為800μg/mL的BSP對細(xì)胞活力有顯著抑制作用（P＜0.05）；處理細(xì)胞48 h后，質(zhì)量濃度為400μg/mL和800μg/mL的BSP對細(xì)胞活力有顯著抑制作用（P＜0.01），400μg/mL時的抑制率約為20%；處理細(xì)胞72 h后，質(zhì)量濃度分別為100，200，400，800μg/mL的BSP對細(xì)胞活力均有顯著抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。綜合考慮，選擇BSP質(zhì)量濃度為400μg/mL，細(xì)胞處理時間為48 h。

圖1 BSP對HepG2細(xì)胞活力的影響Note：Compared with 0μg/mL，*P＜0.05，**P＜0.01.Fig.1 Effect of BSP on the viability of HepG2 cells

2.2 BSP+5-FU對細(xì)胞活力的影響

400μg/mL BSP和0.02 mol/L 5-FU對HepG2細(xì)胞活力的抑制率分別為23%及45%，聯(lián)用后達(dá)56%，與兩者單獨(dú)作用比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見圖2。

圖2 不同藥物對HepG2細(xì)胞活力的影響Note：Compared with those in the control group，△P＜0.01；Compared with those in the 5-FU group，#P＜0.05，##P＜0.01；Compared with those in the BSP group，aP＜0.05，aaP＜0.01（for Fig.2-5）.Fig.2 Effects of different drugs on the viability of HepG2 cells

2.3 細(xì)胞凋亡結(jié)果

BSP+5-FU組的細(xì)胞凋亡率為（47.46±5.15）%，顯著高于BSP組的（17.10±1.45）%（P＜0.01）及5-FU組的（31.03±2.5）%（P＜0.01）。詳見圖3。

圖3 不同藥物對細(xì)胞凋亡的影響A1.Control group A2.5-FU group A3.BSP+5-FU group A4.BSP groupA.Flow cytometry B.Data statisticsFig.3 Effects of different drugs on the apoptosis of HepG2 cells

2.4 Caspase-8，BAX，Bcl-2 mRNA表達(dá)結(jié)果

與對照組比較，BSP+5-FU組Caspase-8，BAX mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），Bal-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。與5-FU組和BSP組比較，BSP+5-FU組Caspase-8、BAX mRNA的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。詳見圖4。

圖4 BAX，Bcl-2，Caspase-8 mRNA表達(dá)水平A.BAX B.Bcl-2 C.Caspase-8Fig.4 Expression levels of BAX，BCl-2，Caspase-8 mRNA

2.5 Caspase-8，BAX，Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果

與對照組比較，BSP+5-FU組Caspase-8、BAX蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。與5-FU組和BSP組比較，BSP+5-FU組Caspase-8，BAX蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；Bcl-2蛋白表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05）。詳見圖5。

圖5 Bcl-2，Caspase-8，BAX蛋白表達(dá)水平B1.Caspase-8 B2.Bcl-2 B3.BAXA.Electrophoretogram B.Data statisticsFig.5 Expression levels of Bcl-2，Caspase-8，BAX protein

3 討論

中醫(yī)藥可在緩解肝癌患者的臨床癥狀、提高其生活質(zhì)量和免疫功能、預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、延緩腫瘤進(jìn)展、延長生存時間等方面發(fā)揮顯著作用，其作用機(jī)制主要體現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬、阻滯細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制轉(zhuǎn)移和血管生成、逆轉(zhuǎn)耐藥、增強(qiáng)化學(xué)藥物治療（簡稱化療）效果等方面［9-11］。20世紀(jì)70年代多糖就被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控細(xì)胞生命活動，并具有重要的生理活性［12］。白及可用于治療消化道黏膜損傷、潰瘍、出血、跌打損傷和燒傷。大量研究表明，BSP具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性［13］，可增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)［14］。

本研究結(jié)果顯示，BSP、5-FU單獨(dú)作用時均可對HepG2細(xì)胞的活力產(chǎn)生抑制作用，兩者聯(lián)用產(chǎn)生的抑制作用較單用更明顯，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，Caspase-8、BAX mRNA表達(dá)水平顯著升高，其蛋白表達(dá)水平亦顯著升高，Bcl-2 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平明顯降低，這可能是BSP+5-FU對肝癌細(xì)胞促凋亡作用的重要機(jī)制之一，仍待進(jìn)一步研究。GAO等［15］的研究表明，多糖與腫瘤細(xì)胞膜具有良好的生物相容性，可能有增加藥物進(jìn)入細(xì)胞的能力，這可能是BSP能大幅增加5-FU活性的原因之一。

綜上所述，在體外條件下，BSP+5-FU可明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其主要機(jī)制可能是通過對凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8，Bcl-2，BAX等基因的調(diào)控發(fā)揮作用，BSP可能通過Caspase途徑促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用，但仍需進(jìn)一步研究。