大棚栽培和仿野生栽培鐵皮石斛正丁醇提取物體外生物活性比較*

廖嫻，梁芷韻，胡莉，黃月純，楊麗娥△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）為蘭科石斛屬多年生草本植物［1］，具有益胃生津、滋陰清熱功效，常用于熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱不退等病癥［2］。由于其生長條件苛刻，自然產(chǎn)量極少，加之長期過度采挖，導(dǎo)致野生資源瀕臨絕種［3］。為解決野生鐵皮石斛資源短缺問題，規(guī)模化鐵皮石斛大棚栽培、人工仿野生栽培等方式作為資源可持續(xù)開發(fā)利用的新模式在國內(nèi)不斷發(fā)展成熟［4］。鐵皮石斛栽培于浙江、云南、廣西、廣東、福建、貴州、四川、江西等地，但由于產(chǎn)地和栽培技術(shù)的不同，導(dǎo)致各地藥材品質(zhì)差異較大。研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛最主要活性成分為多糖類成分，其在抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、保肝和保護胃腸等方面具有明顯的藥理作用［4-5］。目前，對大棚栽培和仿野生栽培鐵皮石斛的研究側(cè)重于其化學(xué)成分的組成和含量分析，對不同栽培方式的生物活性研究則較少。因此，本研究中評價了大棚栽培和仿野生栽培兩種栽培方式下的鐵皮石斛正丁醇提取物體外抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤方面的生物活性，為后期其栽培方式的選擇提供理論參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：CPA225D型分析天平（德國Sartorius公司）；5424R型高速離心機（德國Eppendorf公司）；OptiMair?型超凈工作臺（新加坡Esco公司）；DM2500型熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司）；UFE500型烘箱（德國Memmert公司）；MPR-440F型低溫冰箱（日本Panasonic公司）；Epoch型全波長酶標儀（美國BioTek公司）；Forma 310型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Vi-CELL XR型細胞計數(shù)儀（美國Beckman公司）；AI 800型超靈敏多功能成像儀（美國GE公司）；SBS40型恒溫水浴搖床（英國Stuart公司）。

試藥：DMEM培養(yǎng)基（批號為11965118）、RPMI-1640培養(yǎng)基（批號為11875119）、胎牛血清（批號為10100147）、0.25%胰蛋白酶（批號為25200056）、青霉素-鏈霉素（批號為15140122），均購自美國Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA，批號為A5611）、脂多糖（LPS，批號為L4391）、磷酸（批號為438081）、磺胺（批號為1117990100）、維生素C（VC，批號為PHR1008）、維生素E（VE，批號為47783）、ABTS（批號為11557）、氯化三苯四氮唑（TPTZ，批號為T1253）、總抗氧化能力試劑盒（FRAP法，批號為MAK369）、三氯化鐵（FeCl3，批號為451649）、硫酸亞鐵七水合物（FeSO4·7H2O，批號為12354）、叔丁基過氧化氫（t-BHP，批號為458139）、5-氟尿嘧啶（5-FU，批號為343922），均購自美國Sigma公司；一氧化氮（NO）含量測定試劑盒（批號為S0021S）、CCK-8測定試劑盒（批號為C0042），磷酸鹽緩沖液（PBS，批號為C0221A），雙蒸水（ddH2O，批號為ST876），均購自上海碧云天公司；硫酸、苯酚、無水乙醇均為分析純。大棚栽培鐵皮石斛和仿野生栽培鐵皮石斛，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院黃月純主任中藥師鑒定為鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo的莖。

細胞：大鼠心肌細胞H9c2、巨噬細胞RAW264.7、人肺癌細胞HepG2，均購自中國廣州吉妮歐生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 提取液制備

分別稱取仿野生和大棚栽培鐵皮石斛50.0 g，加70%乙醇800 mL回流提取2次，每次1 h，合并濾液；揮去乙醇液，水液用正丁醇提取2次，每次150 mL，合并濾液，揮干，即得正丁醇提取物。取適量，精密稱定，溶于DMEM培養(yǎng)基中制成質(zhì)量濃度為4 mg/mL的提取物母液，經(jīng)0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。后續(xù)試驗以DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.2.2抗氧化活性檢測

ABTS自由基清除能力［6］：移取質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL的提取液各0.1 mL，置試管中，分別加3.9 mL ABTS工作液，渦旋混合10 s，室溫避光條件下反應(yīng)20 min，以酶標儀測定730 nm波長處的吸光度（OD）值。以水溶性維生素C（Trolox）為參照物繪制標準曲線，提取液對ABTS自由基的清除效果以Trolox等效抗氧化能力（TEAC）值表示。分別以ddH2O和VC（終質(zhì)量濃度均為0.2 mg/mL）為陰性對照和陽性對照。

FRAP總抗氧化能力［6］：移取質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL的提取液各0.1 mL，置試管中，分別加新配的FRAP工作液0.9 mL，渦旋混合10 s，37℃避光條件下反應(yīng)2 h，以酶標儀測定590 nm波長處的OD值。以FeSO4繪制標準曲線，并將OD值轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的FRAP值。分別以ddH2O和VC（終質(zhì)量濃度均為0.2 mg/mL）為陰性對照和陽性對照。

1.2.3 對H9c2細胞衰老的保護作用

采用CCK-8法［7］。取對數(shù)生長期H9c2細胞適量，用DMEM培養(yǎng)基配成1×105/mL的細胞混懸液，以每孔100μL接種于96孔板。細胞貼壁24 h后，吸出培養(yǎng)基，加入終質(zhì)量濃度分別為25，50，100，200μg/mL的提取液，孵育2 h，吸出提取液；加入100μL t-BHP（200μmol/L）溶液，處理2 h，吸出溶液；加入新鮮DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。以酶標儀測定450 nm波長處的OD值，并計算H9c2細胞存活率。分別以PBS和VC（終質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL）為陰性對照和陽性對照。

1.2.4 對巨噬細胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)作用

取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞適量，用DMEM培養(yǎng)基配成5×105/mL的細胞混懸液，以每孔100μL接種于96孔板。細胞貼壁24 h后，吸出培養(yǎng)基，加入終質(zhì)量濃度分別為25，50，100，200μg/mL的提取液，孵育24 h，收集上清液，測定NO水平。分別以PBS和LPS（終質(zhì)量濃度均為10μg/mL）為陰性對照和陽性對照［8］。

1.2.5 對肝癌細胞HepG2增殖的抑制作用

采用CCK-8法［9］。取對數(shù)生長期HepG2細胞適量，用RPMI-1640培養(yǎng)基配成1×105/mL的細胞混懸液，以每孔100μL接種于96孔板。細胞貼壁24 h后，吸出培養(yǎng)基，加入終質(zhì)量濃度分別為50，100，200，400μg/mL的提取液，孵育48 h。以酶標儀測定450 nm波長處的OD值，并計算HepG2細胞增殖抑制率。分別以PBS和5-FU（終質(zhì)量濃度均為50μg/mL）為陰性對照和陽性對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以±s表示，行獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗；利用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計學(xué)軟件作圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外抗氧化活性

隨著提取液質(zhì)量濃度的升高，TEAC值及FRAP值均逐漸升高，且呈濃度依賴性。結(jié)果表明，大棚栽培來源與仿野生栽培來源的鐵皮石斛正丁醇提取物，在0.5～4.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，ABTS自由基清除能力及FRAP總抗氧化能力均相當(dāng)（P＞0.05）。詳見圖1。

圖1 抗氧化活性檢測情況A.ABTS radical scavenging capacity B.FRAP total antioxidant capacityFig.1 Results of antioxidant activity test

2.2 對H9c2細胞衰老的防護作用

隨著提取液質(zhì)量濃度的升高，H9c2細胞存活率逐漸升高，且呈一定的濃度依賴性。結(jié)果表明，在25～200μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大棚栽培來源與仿野生栽培來源的鐵皮石斛正丁醇提取物對t-BHP誘導(dǎo)H9c2細胞衰老的防護作用相當(dāng)（P＞0.05）。詳見圖2。

圖2 H9c2細胞存活情況Fig.2 Survival situation of H9c2 cells

2.3 對巨噬細胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)作用

隨著提取液質(zhì)量濃度的升高，RAW264.7細胞的NO釋放量也逐漸增加，且呈一定的濃度依賴性。結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度分別為100μg/mL和200μg/mL時，仿野生栽培來源鐵皮石斛正丁醇提取物對RAW264.7細胞NO釋放的促進作用顯著強于大棚栽培來源提取物（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖3。

圖3 巨噬細胞RAW264.7 NO釋放情況Note：*P＜0.05，**P＜0.01.Fig.3 NO release from RAW 264.7 macrophages

2.4 對肝癌細胞HepG2增殖的抑制作用

在50～400μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，提取液均可一定程度抑制HepG2細胞生長，在相同質(zhì)量濃度下，大棚栽培來源與仿野生栽培來源的鐵皮石斛正丁醇提取物對HepG2細胞增殖的抑制作用相當(dāng)（P＞0.05）。詳見圖4。

圖4 肝癌細胞HepG2增殖抑制情況Fig.4 Inhibition of HepG2 cells proliferation

3 討論

通過比較不同種源鐵皮石斛的黃酮苷類成分特征圖譜及豐度的差異，可將其區(qū)分為丹霞鐵皮種、浙江本地種、云南廣南種及廣西鐵皮蘭種4種種源，且不同種源仿野生與大棚栽培的鐵皮石斛品質(zhì)也存在差異［10］。浙江本地種鐵皮石斛在仿野生栽培、大棚栽培、純野生栽培方式下的多糖、甘露糖、醇溶性浸出物等多種成分含量存在差異［11］。

ABTS自由基清除能力測試和FRAP法測定總抗氧化能力廣泛用于評價提取物、提取部位等的體外抗氧化活性［6］。本研究中基于上述兩種實驗的結(jié)果，初步推斷在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大棚栽培和仿野生栽培來源的鐵皮石斛正丁醇提取物的體外抗氧化活性及效價相當(dāng)。t-BHP誘導(dǎo)的H9c2細胞衰老模型可評價提取物抗衰老活性［7］。本研究中基于該模型的實驗結(jié)果，初步推斷在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大棚栽培和仿野生栽培來源的鐵皮石斛正丁醇提取物對t-BHP誘導(dǎo)H9c2細胞衰老的保護作用及效價相當(dāng)。肝癌細胞HepG2可初步評價提取物的抗腫瘤活性［9］。本研究結(jié)果提示，大棚栽培和仿野生栽培來源受鐵皮石斛正丁醇提取物均具有一定的抑制HepG2細胞增殖的作用，且作用及效價相當(dāng)。鐵皮石斛可通過多途徑、多層面提高機體免疫功能［6］。巨噬細胞在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)過程發(fā)揮關(guān)鍵作用，常被用于體外免疫活性的研究。巨噬細胞被激活后釋放信號傳導(dǎo)因子NO，進而參與免疫調(diào)節(jié)過程［8，12］。本研究中與大棚栽培來源鐵皮石斛正丁醇提取物比較，仿野生栽培來源提取物可促進巨噬細胞釋放更多的NO，故初步判斷仿野生栽培來源鐵皮石斛正丁醇提取物免疫調(diào)節(jié)作用相對較強。

綜上所述，大棚栽培來源和仿野生栽培來源鐵皮石斛正丁醇提取物體外抗氧化、抗衰老和抗腫瘤方面的活性相當(dāng)；后者免疫調(diào)節(jié)能力優(yōu)于前者。