基于數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡藥理學探討中醫(yī)藥抗呼吸道合胞病毒的用藥規(guī)律及作用機制

摘要：采用數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡藥理學方法分析中藥抗呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus， RSV）用藥規(guī)律，并探討核心中藥可能的作用機制。利用中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫收集治療RSV的含中藥復方，應用SPSS Statistics 26.0軟件對納入標準的中藥進行頻次、性味歸經(jīng)、四氣五味及其功效分類統(tǒng)計，并對頻數(shù)大于5的中藥進行系統(tǒng)聚類分析。使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫分析平臺進行成分、靶點篩選，將其靶點與在GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫篩選得到的RSV疾病靶點進行匹配，獲取高頻中藥抗RSV的關鍵靶點；采用 STRING、DAVID數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點進行蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡分析及京都基因與基因組百科全書通路富集分析；最后通過Cytoscape 3.7.1軟件構建中藥-活性成分-關鍵靶點-通路網(wǎng)絡，并進行拓撲分析。共獲得符合標準的中藥復方91個，涉及121味中藥；其中以清熱藥、化痰止咳平喘藥多見，以歸肺、肝經(jīng)居多，以寒溫平、苦辛甘為主；麻黃、黃芩、甘草、苦杏仁累計頻次最高且聚為一類。獲得麻黃、黃芩、甘草、苦杏仁活性成分共126個；抗RSV關鍵靶點110個，核心靶點包括 GSR、TP53、SOD1等；涉及通路主要包括癌癥通路、流體剪切力與動脈粥樣硬化途徑、AGE-RAGE信號通路、血脂和動脈粥樣硬化血脂等。

關鍵詞：中藥復方；呼吸道合胞病毒；用藥規(guī)律；作用機制；數(shù)據(jù)挖掘；網(wǎng)絡藥理學

中圖分類號：R285文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2023）03-0001-09

Abstract∶The study aims to analyze the anti-respiratory syncytial virus （RSV） dosing pattern of traditional Chinese medicine （TCM） using data mining and network pharmacology， and to explore the possible mechanisms of core TCM. The CNKI database was searched to retrieve TCM prescriptions for treating RSV studies. SPSS Statistics 26.0 was used to classify and explore the qualified TCMs on their frequency， nature， taste， four qi and five flavors and their efficacy. Systematic cluster analysis was performed on the TCMs with a frequency greater than five. The compounds and targets were screened using the traditional Chinese medicine systematic pharmacology analysis platform. The above targets were then matched with the RSV disease targets obtained from GeneCards/OMIM database to obtain the key targets of high frequency anti-RSV TCM. Protein-protein interaction network analysis of the key targets was performed using the STRING platform， DAVID database， and the Kyoto encyclopedia of genes and genomes enrichment analysis. Finally， the Chinese herbal medicine-active ingredient-key target-pathway network was constructed using Cytoscape 3.7.1 software and topology analysis was performed. Ninety-one TCM compound prescriptions were identified which involves 121 TCMs that met the criteria. Among them， heat-clearing drugs， phlegm-relieving， cough-suppressing， and asthma-suppressing drugs were mostly found， with the majority attributed to the lung and liver meridians， mainly cold， warm， flat， bitter， pungent， and sweet. Ephedrae Herba， Scutellariae Radix， licorice， and Amygdalus Communis Vas had the highest cumulative frequency and were clustered into one category. A total of 126 active ingredients of Ephedra Herba， Scutellariae Radix， Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma， and Armeniacae Semen Amarum were obtained. A total of 110 anti-RSV key targets were obtained， the core targets include GSR， TP53， SOD1， etc.， cancer pathway， fluid shear and atherosclerosis pathway， AGE-RAGE signaling pathway， blood lipids and atherosclerotic lipids， etc.

Key words∶traditional Chinese medicine compounding; respiratory syncytial virus; dosing pattern; mechanism of action; data mining; network pharmacology

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus， RSV）為單股負鏈RNA病毒，隸屬副黏液病毒科、肺病毒屬，是誘發(fā)嬰幼兒下呼吸道疾病最主要的病原體，同時還是致使老年人群和某些免疫抑制人群發(fā)病及死亡的重要原因。2022年《柳葉刀》研究表明，每年約有3 300萬RSV患者相關急性下呼吸道感染發(fā)作，360萬患者因RSV相關急性下呼吸道感染住院，2.63萬例RSV相關急性下呼吸道感染者住院死亡[1]。目前尚缺乏安全性能高、特異性強的針對機體RSV感染后的臨床治療措施。因此，探索發(fā)現(xiàn)高效抗RSV的藥品，對防控RSV感染意義重大。西醫(yī)治療RSV感染以對癥和支持治療為主，治療效果并不理想，且臨床用于預防或治療RSV感染的藥物甚少。傳統(tǒng)中藥作為新藥開發(fā)的重要資源，在體內外醫(yī)治病毒感染性疾病方面表現(xiàn)出了獨特優(yōu)勢。

中醫(yī)應用清熱類中藥抗病毒歷史悠久，臨床上有大量的經(jīng)方和驗方，具有清里熱、瀉火、涼血、解毒功效，如定喘湯[2]、雙黃連[3]、清肺口服液[4]等能夠對RSV進行治療，組分含有金銀花、連翹、梔子、黃芩等，可以緩解病毒感染的并發(fā)癥，縮短病程，抑制機體過度炎癥反應、調節(jié)免疫平衡、保護相關性臟器。因此，從清熱類中藥特別是入肺經(jīng)的中藥中開發(fā)治療RSV的新藥，具有深厚的歷史淵源和良好的前景，成功幾率大。本文運用中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫構建“方藥”-RSV關聯(lián)網(wǎng)絡，篩選既能入肺經(jīng)，又對RSV有殺傷力的清熱類中藥藥物群，為深入挖掘中醫(yī)藥精華、創(chuàng)新中醫(yī)藥應用做出貢獻。

1資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源

通過中國知網(wǎng)（https：//www.cnki.net）將“呼吸道合胞病毒”和“中醫(yī)藥”或“RSV”和“中醫(yī)藥”作為主題詞，檢索有關中醫(yī)藥治療RSV的相關文獻，檢索時間為1990-01-01—2021-12-21。

1.2處方納入與排除標準

納入中醫(yī)藥治療RSV的臨床文獻，且組方完整；排除綜述及理論探討非臨床的或組方不完整的文獻。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

共篩選得到176篇文獻，將文獻中91個組方中涉及的中藥及其性味歸經(jīng)等，參照2020年版《中國藥典》[5]規(guī)范化處理，如將“生薏苡仁”規(guī)范為“薏苡仁，”將“生石膏”規(guī)范為“石膏”等，并將處理過的數(shù)據(jù)錄入Microsoft Excel 2020軟件中，運用可視化軟件進行數(shù)據(jù)呈現(xiàn)。

1.4數(shù)據(jù)庫與分析軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺 （traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP） （https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）是一個用于中藥的系統(tǒng)級藥理學數(shù)據(jù)庫，收納了《中國藥典》499種中草藥的化學成分、ADME參數(shù)等信息；京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）（https：//www.kegg.jp/）；STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）；UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）；DAVID數(shù)據(jù)庫（https： //david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape 3.7.1軟件（https：//cytoscape.org/）；RCSB PDB（https：//www.Rcsb.org/）；PyMol 2.3.0（ https：//pymol.org/）；AutoDock Tools 1.5.6（http：//mgltools.scripps.edu/）；Vina（http：//vina.Scripps.edu /）；Python 3.7（https：//www.python.org/）。

2結果

2.1頻次統(tǒng)計

共獲得91個處方，121味中藥，累計頻次303。其中頻次≥5的中藥共有15味，見表1。排名靠前的中藥包括麻黃、黃芩、甘草和苦杏仁。

2.2功效、歸經(jīng)及四氣五味統(tǒng)計

對121味中藥進行功效、歸經(jīng)、四氣五味分類統(tǒng)計。功效排名靠前的為清熱藥（38次，31.4%）、化痰止咳平喘藥（22次，18.2%）、解表藥（15次，12.4%），見圖 1（a）；歸經(jīng)排序靠前的為肺（80次，26.9%）、肝（43次，14.5%）、胃（42 次，14.1%）的占比較大，見圖1（b）；四氣排序靠前的為寒（55次，45.5%）、溫（36次，29.8%）、平（14次，11.6%），見圖 1（c）；五味排序靠前的為苦（70 次，37.8%）、辛（57次，30.8%）、甘（37次，20%），見圖 1（d）。

2.3聚類分析

運用 SPSS Statistics 26.0軟件對15味高頻中藥（頻次≥5次）進行聚類分析，采用沃德聯(lián)接的聚類方法，橫坐標數(shù)字是各類別的相對距離，是按距離比例重新設定的結果；縱坐標表示被聚類的所有中藥種類。通過樹形圖觀察到15味中藥，當分為3類時，甘草、苦杏仁、麻黃、黃芩被歸為一類，金銀花、桑白皮、石膏被分為一類，剩下的藥物為一類。麻黃、黃芩、甘草、苦杏仁出現(xiàn)頻次最高且聚為一類，見圖2。

2.4高頻中藥麻黃、黃芩、苦杏仁、甘草抗RSV的作用機制分析

2.4.1成分及靶點篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.05[6]為篩選條件得麻黃活性成分6個、黃芩活性成分24個、苦杏仁活性成分8個、甘草活性成分92個，刪除重復項后共計126個活性成分，406個靶點。

2.4.2疾病關鍵靶點的篩選

在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中查尋得到RSV相關的疾病靶點780個，與麻黃、黃芩、苦杏仁、甘草的406個活性成分靶點匹配映射，得到共同靶點110個，即為麻黃、黃芩、苦杏仁、甘草抗RSV的關鍵靶點。

2.4.3中藥-活性成分-關鍵靶點網(wǎng)絡分析

將中藥、活性成分、關鍵靶點導入 Cytoscape 3.7.1軟件，構建中藥-活性成分-關鍵靶點網(wǎng)絡，見OSID科學數(shù)據(jù)與內容附圖1。網(wǎng)絡中有285個節(jié)點（4味中藥，153個關鍵靶點，126個活性成分），536條邊。節(jié)點度值越大即表明活性成分在抗RSV過程中發(fā)揮的作用越大，該網(wǎng)絡的平均度值為4.25，大于平均度值的主要核心成分見表2，全表見OSID科學數(shù)據(jù)與內容附表1。其中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、漢黃芩素、山姜素、韌黃芩素I、柚皮素、草質素甘、雌酮、豆甾醇、天竺素、黃芩素、去甲漢黃芩素、千層紙素A、三裂鼠尾草素、谷甾醇等化合物的度值排名靠前，表明這些化合物可能在抗RSV中發(fā)揮關鍵作用。

2.4.4關鍵靶點蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡分析

將麻黃、黃芩、苦杏仁、甘草抗RSV的110個關鍵靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，并使用Cytoscape 3.7.1 軟件，設置節(jié)點大小及顏色，得到蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡（取度值gt;20.66），見OSID科學數(shù)據(jù)與內容附圖2。度值越大說明靶點在 PPI 網(wǎng)絡中的位置越重要，得到麻黃、黃芩、苦杏仁、甘草抗RSV的核心靶點包括 GSR、TP53、SOD1、EGFR、CYP3A4、GSTP1、TNF、IL-1β、GSK3B、PTGS2等，具體見表3。

2.4.5關鍵靶點KEGG通路分析

將110個關鍵靶點基因導入 DAVID 數(shù)據(jù)庫中進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。結果顯示，110個關鍵靶點基因涉及到160條通路，根據(jù)靶點基因數(shù)目及P 值將前20條繪制氣泡圖，見圖3。圖中橫軸代表富集因子，縱軸為通路名稱，氣泡大小代表作用于該通路的基因數(shù)，顏色代表P值。麻黃、黃芩、苦杏仁、甘草抗RSV的主要通路包括癌癥通路、流體剪切力與動脈粥樣硬化途徑、AGE-RAGE 信號通路、血脂和動脈粥樣硬化等。

2.4.6成分-靶點-通路網(wǎng)絡構建

采用Cytoscape軟件構建成分-靶點-通路網(wǎng)絡，見OSID科學數(shù)據(jù)與內容附圖3。所選擇的KEGG通路分析結果前20條通路，共涉及71個靶點，其中麻黃、黃芩、苦杏仁、甘草4 味藥共同作用的靶點有65個。20條通路中靶點所對應的中藥活性成分有11個，其中來自麻黃、黃芩、苦杏仁、甘草的活性成分各有2、5、1、3 個。網(wǎng)絡中度值靠前的活性成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、韌黃芩素I等，度值靠前的靶點有MAPK3、MAPK1、JUN等，度值靠前的通路有癌癥通路、血脂和動脈粥樣硬化、流體剪切力與動脈粥樣硬化途徑等。

2.4.7分子對接

為了進一步驗證篩選出的活性成分及核心靶點，將 2.4.3 項下關鍵化合物與核心作用靶點及 RSV 結構靶點進行分子對接。從 RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中共獲取了3個靶點蛋白：GSR（3DK9）、TP53（2KBF）、SOD1（5J0F）。以格點打分為參考，分數(shù)絕對值越大，匹配程度越高。天竺素與GSR、TP53、SOD1的格點打分分別為-8.924、-6.138和-6.001。槲皮素與GSR、TP53、SOD1的格點打分分別為-7.745、-5.323和-4.156，全圖見OSID科學數(shù)據(jù)與內容附圖4。分子對接結果（圖4）說明清熱類藥物天竺素和槲皮素可能通過GSR、TP53、SOD1靶點發(fā)揮抗RSV作用。

3討論

RSV是一種有胞膜、非節(jié)段的單股負鏈RNA病毒，也是引起兒童哮喘、急性支氣管炎、間質性肺炎等呼吸道疾病的主要病原體[7]。在辨證論治理論指導下的中藥復方對RSV的臨床療效確切。為了更好地總結并傳承眾醫(yī)家學術思想與用藥經(jīng)驗，本研究借助數(shù)據(jù)挖掘并參考《網(wǎng)絡藥理學評價方法指南》[8]，對中藥復方抗RSV進行整理，旨在闡明中藥治療RSV的一般規(guī)律及高頻中藥的作用機制，以利于提高中醫(yī)藥治療RSV的臨床療效。

將符合納入標準的91個復方所含中藥進行功效、歸經(jīng)、四氣五味的分析統(tǒng)計，結果表明抗RSV的中藥以清熱藥為主，化痰止咳平喘藥次之。根據(jù)RSV感染性疾病的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)認為與“外感表熱”癥狀的相關，與“風寒感冒”癥狀相似，均由中氣不足及外感風邪、正虛邪實，同時肺氣雍遏所致，治宜宣肺平喘、泄熱、化痰、清瘟解毒[9]。歸經(jīng)分析提示，抗RSV的中藥主要歸肺經(jīng)，RSV的病變臟腑主要在肺，其次病位在表衛(wèi)。《溫病經(jīng)紳》指出 “溫邪上受，首先犯肺”。溫邪入侵，正邪相抗，故發(fā)熱；繼而，邪熱奎肺，清肅失司，熱則傷津，故咳嗽，喘促氣急口渴。抗RSV的中藥以寒溫平、苦辛甘為多，寒性味苦中藥多具有清熱解毒功效。

本研究以中醫(yī)理論為基礎，發(fā)現(xiàn)麻黃、黃芩、苦杏仁、甘草通過多個組分、多個靶點、多條通路全方位、整體調控機體來治療病毒性肺炎，有效抑制病毒性肺炎由輕癥向重癥轉化，快速改善患者疾病癥狀、控制病情進展、縮短療程。麻黃中的成分槲皮素[10]的兩個位點與hRSV的M2-1蛋白相互作用，從而避免病毒復制和萌發(fā)；麻黃中的另一個成分山柰酚已被證明是流感病毒的潛在抑制劑[11]。Ma等[12]用細胞病理效應法檢測了44種中草藥對RSV的抑制作用，其中黃芩中的苦參堿、氧化苦參堿、苦參素、漢黃素和苦參素A皆為有效抗RSV活性成分。已有的研究發(fā)現(xiàn)IL-17通路[13-15]、TH-17通路[16-17]、TNF通路[18-19]和RSV疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，CYP3A4[20]、EGFR[21-22]、GSK3B[23]、IL-1β[24-25]、SOD1[26-27]、PTGS2[26-27]、TP53[28]是抗RSV的關鍵靶點。多數(shù)清熱類中藥通過多組分干預TLR信號通路的TLR4、TLR3、TLR2/6、TLR7/8等、MAPK信號通路和核轉錄因子NF-κB等傳導通路，介導炎癥反應的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗RSV感染的作用。分子對接結果顯示，天竺素和槲皮素與GSR、TP53、SOD1的對接情況最好，可能涉及癌癥通路、流體剪切力與動脈粥樣硬化途徑、AGE-RAGE信號通路、血脂和動脈粥樣硬化等，共同發(fā)揮抗RSV的作用。

清熱類中藥在防治RSV感染上效果顯著，安全性高。但清熱類中藥抗RSV相關研究多處于實驗階段，其中存在若干重要問題，如清熱類中藥活性成分抗病毒理論支持甚少，供參考的相關實驗資料較少，研究思路缺乏創(chuàng)新，多效仿西藥模式，缺少中藥傳統(tǒng)功效、性味歸經(jīng)等性能的融入。我們應深入挖掘中醫(yī)藥抗RSV感染的細胞、蛋白分子以及基因水平的藥理學關鍵機制，全面揭示清熱類中藥抗病毒作用的優(yōu)勢。在進一步明確清熱類中藥抗病毒作用機制的基礎上，研制出高效、低毒的抗病毒藥物，是當下中醫(yī)藥研發(fā)工作中的重點方向。

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