燕麥種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環對外源H2O2引發的響應

摘要：本研究探討了外源H₂O₂引發后，燕麥（Avena sativa）種胚細胞和線粒體抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）-谷胱甘肽（Glutathione，GSH）循環的抗氧化性能的變化規律，以期為植物種子的長期貯藏技術研究提供理論依據。試驗以燕麥種子為材料，用濃度為0，0.96，1.92，3.84和7.68 mol·L^-1的H₂O₂引發12 h后，分析其種胚細胞和線粒體脂質過氧化水平、AsA-GSH循環中酶促和非酶促抗氧化物質的變化規律。結果表明：燕麥種胚細胞和線粒體內AsA和GSH含量會隨外源H₂O₂濃度的增加而顯著降低（Plt;0.05），其AsA-GSH循環的酶活性、脫氫抗壞血酸和氧化型谷胱甘肽含量均呈先升后降的趨勢，其H₂O₂和丙二醛含量顯著升高（Plt;0.05），燕麥種子發芽率則顯著降低（Plt;0.05）。燕麥種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環的抗氧化功能變化對H₂O₂濃度升高的響應具有協同性，其抗氧化能力下降導致高濃度（≥1.92 mol·L^-1）外源H₂O₂引發下燕麥種子發芽率降低，而其AsA含量及再生能力的降低是造成這一現象的主要原因。

關鍵詞：抗壞血酸-谷胱甘肽循環；線粒體；過氧化氫；燕麥；種子引發

中圖分類號：S512.6文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）04-1064-07

Response of AsA-GSH Cycles to Exogenous H₂O₂ Priming in the Embryonic

Cells and Mitochondria of Oat Seeds

LI Hong-yu， WANG Ya-cong， XIA Fang-shan WANG Bo， LI Yin-lin， ZHANG Jie-min

（College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：In this study，the changes in the antioxidant properties of ascorbic acid （AsA）-glutathione （GSH） cycles were explored as a response to exogenous H₂O₂ priming in the embryonic cells and mitochondria of oat （Avena sativa） seeds，which provided a theoretical basis for the long-term storage of plant seeds. Oat seeds were primed with 0，0.96，1.92，3.84 and 7.68 mol·L^-1 H₂O₂ for 12 h as the experimental materials，and the changes in lipid peroxidation and enzymatic and non-enzymatic antioxidants in AsA-GSH cycles were analyzed in both their embryonic cells and mitochondria. The results showed that the AsA and GSH contents were significantly decreased in the embryonic cells and mitochondria （Plt;0.05），and enzymatic activities of AsA-GSH cycles and contents of dehydroascorbate and oxidized glutathione were all with a pattern of increasing firstly and then decreasing. H₂O₂ and malondialdehyde contents were also significantly increased （Plt;0.05），and thus the germination percentage of oat seeds was reduced significantly （Plt;0.05）. Embryonic cells and mitochondria showed similar results of changes of AsA-GSH cycles in response to the increase of H₂O₂ concentration，and the damage on their antioxidant capacity resulted in the decrease of seed germination under priming with high concentration （≥1.92 mol·L^-1） of exogenous H₂O₂. It might be caused largely by the decrease of AsA content and its continuous production.

Key words：Ascorbic acid-glutathione cycles;Mitochondria;Hydrogen peroxide;Oat;Seed priming

種業是決定國家穩定發展的基礎性和戰略性核心產業，已成為推動我國農牧業高質量發展的重要引擎［1］。種子活力水平是直接決定著民族種業高質量發展的關鍵因素，其在儲藏中會因為活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的不斷積累而逐步降低［2］。H₂O₂的產生與清除是植物維持細胞內ROS動態平衡的關鍵環節，其過量積累成為引起貯藏種子活力不斷下降的關鍵原因［3-4］。線粒體是種胚細胞內最主要的細胞器，其既是種胚細胞內ROS產生的最主要來源，又是種胚細胞內ROS攻擊的首要目標，因而是對種子劣變最敏感的細胞器［5］。抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）-谷胱甘肽（Glutathione，GSH）循環是種子內維持其壽命的諸多系統中最為活躍的核心環節，因而是種胚細胞和線粒體內維持ROS穩態的重要渠道［6-7］。研究發現，輕度老化會誘導植物種胚細胞和線粒體內AsA-GSH循環中抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX），谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR），超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate reductase，DHAR）和單脫氫抗壞血酸還原酶（Monodehydroasorbate reductase，MDHAR）活性升高，其H₂O₂和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量維持一個相對較低的水平，因而其種子活力也基本未降低，但重度老化時則出現完全相反的現象［8-11］。外源H₂O₂引發下燕麥種胚細胞和線粒體中也發現了相似的變化規律［12-13］。老化燕麥種子的種胚細胞與線粒體在引發過程中會協同發揮作用，且線粒體是其發揮清除ROS作用的最主要部位［14］。然而，植物種胚細胞及線粒體AsA-GSH循環如何協同響應外源H₂O₂引發處理尚未見報道，其是否與老化種子的引發處理具有相同的規律也仍然不清楚。所以本試驗旨在探討燕麥種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環對不同濃度外源H₂O₂引發的響應，以驗證內源H₂O₂含量變化與種子活力水平的內在關系，從而為精確揭示種子老化的內在抗氧化機制提供理論依據。

1材料與方法

1.1H₂O₂引發處理

將均勻飽滿的‘太陽神’燕麥種子（具體來源及詳細信息見文獻［12-13］）分為約10 g每份，并參照文獻［15］的方法將其含水量調整至鮮重基礎約10%，然后用200 mL濃度分別為0，0.96，1.92，3.84和7.68 mol·L^-1的H₂O₂在室溫黑暗條件下浸泡12 h后，快速用蒸餾水沖洗3次，用濾紙吸掉其表層水分后，于室溫黑暗環境中風干至含水量10%（鮮重基礎）左右時進行密封，并于4℃下保存備用。以未引發處理的燕麥種子作為對照（CK）。每個處理重復4次。

1.2發芽試驗

按照國際種子檢驗協會發布的種子檢驗規程（2017）［16］規定的條件進行，具體操作方法參照文獻［17］進行，并按照公式Gp=（G₁₀/N）×100%來計算其發芽率，式中Gp代表種子發芽率，G₁₀代表末次計數第10天時的正常發芽種子數，N代表供試發芽種子的總數［16］。

1.3生理指標的測定

提取種胚細胞粗酶液參考Kibinza等［18］的方法，具體操作參照文獻［12］進行；提取與純化種胚線粒體則參照Yin等［19］的方法，具體操作參照文獻［13］進行。測定可溶性蛋白和H₂O₂含量采用了建成生物工程研究所的試劑盒，測定MDA含量參考Bailly等［20］的方法，測定SOD活性參考Rao等［21］的方法，測定APX和DHAR活性參考Nakano等［22］的方法，測定MDHAR活性參考Arrigoni等［23］的方法，測定GR活性參考Esterbauer等［24］的方法，測定AsA和脫氫抗壞血酸（Dehydroascorbic acid，DHA）含量參照Kampfenkel等［25］的方法，測定GSH和氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）含量參照Griffith［26］的方法。

1.4數據分析

采用SPSS 21.0和Excel 2010統計軟件整理試驗數據，并進行方差分析，多重比較則用Duncans法（P＜0.05），以“平均值±標準誤”表示最后結果。

2結果與分析

2.1燕麥種子發芽率的變化

由圖1可知，燕麥種子的發芽率在H₂O₂濃度為0 mol·L^-1時與CK無顯著性差異，但在H₂O₂濃度≥0.96 mol·L^-1時顯著低于CK（Plt;0.05），且在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時為0。

2.2燕麥種胚細胞和線粒體內H2O2和MDA含量變化

燕麥種胚細胞和線粒體內MDA和H₂O₂含量隨H₂O₂濃度的增大呈不斷上升趨勢（圖2）。0 mol·L^-1 H₂O₂引發時，燕麥種胚細胞和線粒體內MDA，H₂O₂含量均與CK無顯著性差異，但0.96～7.68 mol·L^-1 H₂O₂引發時，燕麥種胚細胞和線粒體內MDA和H₂O₂含量呈顯著升高趨勢（Plt;0.05），且均顯著高于CK（Plt;0.05）。H₂O₂濃度為0～1.92 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內H₂O₂含量低于線粒體內，但H₂O₂濃度為3.84 mol·L^-1和7.68 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內H₂O₂含量則高于線粒體內；H₂O₂濃度為0和0.96 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內MDA含量低于線粒體內，但H₂O₂濃度為1.92～7.68 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內MDA含量則高于線粒體內。

2.3燕麥種胚細胞和線粒體內抗氧化酶活性變化

燕麥種胚細胞和線粒體內SOD，APX，GR，MDHAR和DHAR活性隨H₂O₂濃度的增大呈先升后降趨勢（圖3）。H₂O₂濃度為0 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞和線粒體內SOD，APX，GR，MDHAR和DHAR活性都與CK無顯著性差異。種胚細胞SOD和GR活性在H₂O₂濃度為1.92 mol·L^-1時顯著高于其他濃度時（Plt;0.05），但其種胚線粒體SOD和GR活性在0.96 mol·L^-1 H₂O₂引發時顯著高于其他濃度時（Plt;0.05）；種胚細胞及線粒體SOD活性在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時仍均顯著高于CK（Plt;0.05），種胚細胞GR活性在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時也仍顯著高于CK（Plt;0.05），但其種胚線粒體GR活性在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時則顯著低于CK（Plt;0.05）。種胚細胞APX活性在H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時顯著高于其他濃度時（Plt;0.05），其種胚線粒體APX活性在1.92 mol·L^-1 H₂O₂引發時顯著高于其他濃度時（Plt;0.05）；種胚細胞APX活性在H₂O₂濃度為3.84 mol·L^-1時已顯著低于CK（Plt;0.05），但其種胚線粒體APX活性在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時才顯著低于CK（Plt;0.05）。種胚細胞和線粒體MDHAR和DHAR活性在0.96 mol·L^-1 H₂O₂引發時均顯著高于其他濃度時（Plt;0.05）；種胚細胞MDHAR和DHAR活性在H₂O₂濃度為3.84 mol·L^-1時均已顯著低于CK（Plt;0.05），其種胚線粒體MDHAR活性則在H₂O₂濃度為1.92 mol·L^-1時就已顯著低于CK（Plt;0.05），而種胚線粒體DHAR活性則在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時才顯著低于CK（Plt;0.05）。

2.4燕麥種胚細胞和線粒體內AsA含量變化

隨著H₂O₂引發濃度的增加，燕麥種胚細胞和線粒體內AsA含量均呈現逐漸下降趨勢，而兩者DHA含量則均呈現先升高后降低的趨勢（圖4）。H₂O₂濃度為0 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內AsA含量顯著高于CK（Plt;0.05），但其種胚線粒體內AsA含量則與CK無顯著性差異，燕麥種胚細胞和線粒體內DHA含量均與CK無顯著性差異。燕麥種胚細胞和線粒體AsA含量均在H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時就顯著低于CK（Plt;0.05），在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時顯著低于其他濃度（Plt;0.05）；燕麥種胚細胞DHA含量在H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時快速上升，并顯著高于其他濃度時（Plt;0.05），而其種胚線粒體DHA含量在1.92 mol·L^-1 H₂O₂引發時仍顯著高于其他濃度時（Plt;0.05），且其種胚細胞和線粒體DHA含量均在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時仍顯著高于CK（Plt;0.05）。

2.5燕麥種胚細胞和線粒體內GSH含量變化

隨著H₂O₂引發濃度的增加，燕麥種胚細胞和線粒體內GSH含量均呈現逐漸下降趨勢，而其種胚細胞和線粒體內GSSG含量則均呈現先升高后降低的趨勢（圖5）。H₂O₂濃度為0 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內GSH和GSSG含量均與CK無顯著差異。燕麥種胚細胞和線粒體GSH含量均在H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時已顯著低于CK（Plt;0.05），在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時顯著低于其他濃度（Plt;0.05）；燕麥種胚細胞和線粒體GSSG含量在H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時均顯著高于其他濃度時（Plt;0.05），而在7.68 mol·L^-1 H₂O₂引發時均顯著低于其他濃度時（Plt;0.05）；但燕麥種胚細胞GSSG含量在H₂O₂濃度為3.84 mol·L^-1時已顯著低于CK（Plt;0.05），而其種胚線粒體GSSG含量則在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時才顯著低于CK（Plt;0.05）。

3討論

H₂O₂在植物體內所發揮的生理生化作用具有明顯的濃度效應，低濃度時是植物細胞內抵御各種非生物脅迫的小分子信號物質，但高濃度時則會引起植物細胞的程序性死亡［27-28］。因此，外源H2O2引發處理對種子萌發的影響與其濃度具有密切關系［17］。本試驗發現，低濃度（0.96 mol·L^-1）H₂O₂引發處理時，燕麥種子發芽率與濃度為0 mol·L^-1及CK間無顯著性差異，說明低濃度的H₂O₂引發能使高活力（發芽率可達100%）燕麥種子的發芽率保持較高水平，這與前人在水稻（Oryza sativa）［29］、臭椿（Ailanthus altissima）［30］及莖瘤芥（Brassica juncea）［31］等植物種子的研究中存在差異，主要是因為前人所有種子的發芽率幾乎都不高于80%，而低活力種子需要一定的H₂O₂誘導才能激活其萌發代謝及相關免疫反應［17］。高濃度（≥1.92 mol·L^-1）H₂O₂引發處理時，燕麥種子發芽率顯著降低（Plt;0.05），濃度為7.68 mol·L^-1時已基本喪失活力，這與在水稻［29］、臭椿［30］及莖瘤芥［31］等植物種子中的研究結論相似。這可能是高濃度H₂O₂處理使其在植物種子內迅速積累而導致了細胞膜系統的損傷，從而造成種子內電解質和大量代謝物質的外滲，最終表現為種子喪失活力［32］。

燕麥種子內H₂O₂的過量積累會使其抗氧化酶活性大幅度降低，并導致其種胚細胞和線粒體發生脂質過氧化損傷，表現為兩者MDA含量大量增加［9-10］。因此，高濃度H₂O₂引發處理引起的脂質過氧化損傷可能是導致燕麥種子活力逐漸喪失的主要原因［17］。試驗中，燕麥種胚細胞和線粒體SOD，APX，GR，MDHAR和DHAR活性，以及兩者內MDA，H₂O₂，AsA，GSH，DHA和GSSG含量變化均具有相同的規律，說明燕麥種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環對于外源H₂O₂引發的響應具有協同性，這與PEG引發下老化燕麥種子的響應一致［14］。低濃度（0.96 mol·L^-1）H₂O₂引發處理時，燕麥種胚細胞和線粒體內H₂O₂含量已均顯著高于濃度為0 mol·L^-1及CK（Plt;0.05），這說明已經造成了燕麥種胚細胞和線粒體內H₂O₂積累，因而其MDA含量也顯著高于CK（Plt;0.05），表明發生了脂質過氧化損傷。此時，燕麥種胚細胞和線粒體內SOD，APX，GR，MDHAR和DHAR活性也均顯著高于濃度為0 mol·L^-1及CK（Plt;0.05），這說明此時燕麥種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環的關鍵酶仍具有較高的清除ROS的能力，因而其AsA和GSH含量會顯著低于濃度為0 mol·L^-1及CK（Plt;0.05），且其DHA和GSSG含量則均顯著高于濃度為0 mol·L^-1及CK（Plt;0.05），這說明AsA和GSH被作為AsA-GSH循環的底物而大量用于清除種胚細胞及線粒體內ROS［33］。然而H₂O₂濃度為1.92 mol·L^-1時，盡管燕麥種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環的關鍵酶的活性仍保持較高水平，但其抗氧化能力已經開始逐漸減弱，表現為其種胚細胞和線粒體MDHAR和DHAR活性顯著低于H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時（Plt;0.05），其AsA和GSH含量也繼續顯著降低（Plt;0.05），因而其H₂O₂和MDA含量也繼續顯著增加（Plt;0.05），燕麥種子的發芽率也顯著降低（Plt;0.05）。種子內AsA-GSH循環中MDHAR，DHAR及GSH的主要功能是使循環中AsA能夠再生［33］，因而高濃度H₂O₂造成AsA含量及其再生功能降低是導致燕麥種子活力喪失的主要原因，這是因為燕麥種子內MDHAR和DHAR對于AsA的再生具有更重要的催化作用［15，34］。

4結論

燕麥種子發芽率在高濃度外源H₂O₂引發下降低是其種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環的抗氧化功能降低造成的，二者對H₂O₂濃度升高的響應具有協同性，而種胚細胞和線粒體內AsA含量及其再生功能降低是高濃度H₂O₂造成燕麥種子活力逐漸喪失的主要原因。

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（責任編輯 閔芝智）