農桿菌介導的葡萄風信子愈傷組織遺傳轉化體系的優化

摘要：葡萄風信子（Muscari spp.）為百合科葡萄風信子屬植物的總稱，該屬植物多具有稀少的正藍色花色，是研究單子葉植物花青苷合成機理的模式材料。為開發一種高效的葡萄風信子遺傳轉化體系，本試驗以葡萄風信子常見種亞美尼亞（M. armeniacum）、栽培品種‘黑眼睛’（M. aucheri ‘Dark Eyes’）為材料，用葉片和花蕾分別誘導獲得愈傷組織，對愈傷組織的潮霉素敏感性進行測試，對根癌農桿菌介導的愈傷組織遺傳轉化體系進行優化。試驗結果表明：葡萄風信子亞美尼亞和‘黑眼睛’愈傷組織的潮霉素臨界濃度分別為150 mg·L- 1和120 mg·L- 1。GUS染色結果顯示不同基因型、不同農桿菌菌株及不同功率超聲處理的愈傷組織瞬時轉化效率差異不顯著。而液體培養的花源愈傷組織能獲得更高的瞬時轉化效率，為葡萄風信子遺傳轉化的最優受體。其最高瞬時轉化效率為98.73%。試驗共獲得了209塊抗性愈傷組織，經PCR和RT-PCR檢測，陽性率可達90%。本研究為在葡萄風信子中快速有效的開展基因功能研究奠定了技術基礎。

關鍵詞：葡萄風信子；愈傷組織；根癌農桿菌；遺傳轉化

中圖分類號：S682.2+9文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）03-1234-08

Optimization of Agrobacterium Tumefaciens-Mediated Genetic Transformation

System based on Callus of Grape Hyacinth

TIAN Shu-ting， CAO Xiao-yun， SHI Chun-ying， DU Ling-juan

（College of Landscape Architecture and Art， Northwest Aamp;F University， Yangling， Shaanxi Province 712100， China）

Abstract：Grape hyacinth （Muscari spp.） included all species in the Muscari genus of Liliaceae，and is a model plant for the mechanism study on anthocyanin synthesis in monocots due to its rare blue color. In this study，the hygromycin sensitivity of callus induced from a common species M. armeniacum and the cultivar of M. aucheri ‘Dark Eyes’ were tested，and an optimized genetic transformation system based on callus and Agrobacterium tumefaciens was developed. The results showed that the critical concentrations of hygromycin were 150 mg·L-1 and 120 mg·L-1for leaf-and-flower-derived calli of M. armeniacum and M. aucheri ‘Dark Eyes’，respectively. There were no significant differences of transformation efficiencies among different genotypes，among different Agrobacterium strains and among different ultrasonic power，based on GUS staining. The highest transient genetic transformation efficiency of 98.73% was received for flower-derived calli cultured in liquid culture method. A total of 209 pieces of resistant calli were obtained，and the transformation success rate was 90% based on examinaitons of PCR and RT-PCR. The present study provides an efficient technical support for the functional researches of genes in grape hyacinth.

Key words：Grape hyacinth;Callus;Agrobacterium tumefaciens;Genetic transformation

葡萄風信子（Muscari spp.），又名藍壺花，引自歐洲，是百合科葡萄風信子屬植物的總稱，多年生球根花卉，因其花型奇特似葡萄而得名。葡萄風信子適應性強，花期較早，花色艷麗，且多呈現自然中稀少的正藍色，具有較高的觀賞和科研價值，是研究單子葉植物花青苷生物合成和花色形成機理的模式材料［1］。早期葡萄風信子的研究主要集中在物候觀測、花期調控、倍性鑒定、組培再生、離體開花、花色形成及相關成分測定等方面［2-6］。近年來，隨著測序技術的發展，越來越多與葡萄風信子花青苷合成相關的基因被分離出來［7-9］，基因功能的解析已成為當前研究的主要目標。然而，葡萄風信子缺乏高效的遺傳轉化體系，這限制了其基因功能的深入研究。

根癌農桿菌介導的遺傳轉化作為基因工程最常用的方法之一，廣泛應用于植物的各個研究領域當中［10］。并在禾本科、百合科、蘭科等單子葉植物中，展現出極大的應用潛力［11-13］。葡萄風信子農桿菌介導的遺傳轉化也有了少量的研究，影響轉化效率的因素如篩選及抑菌抗生素的適宜濃度、菌株載體組合、乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）濃度等均已得到了初步的篩選。Suzuki等［14］通過農桿菌介導的葉源胚性愈傷的轉化方法，首次得到了葡萄風信子‘藍珍珠’（M. armeniacum ‘Blue Pearl’）轉基因植株的生產系統；試驗顯示，EHA101/pIG121Hm的菌株/載體組合、100 μmol·L^-1 AS和0.1％Tween20存在時能獲得更高的轉化效率。許勝［15］在建立葡萄風信子‘白葡萄’（M. botryoides ‘Album’）葉源愈傷組織遺傳轉化體系時發現，預培養3 d、侵染5 min、菌液濃度為0.7、共培養3 d的愈傷組織抗性芽分化數最高。經PCR檢測，抗性芽的轉化率為1.56％。張海芹等［16］以葡萄風信子亞美尼亞的葉源愈傷組織為受體，初步建立了葡萄風信子亞美尼亞的遺傳轉化體系；結果表明，當農桿菌菌液OD600為0.5、侵染20 min、共培養4 d、80 W功率超聲波預處理3 min時，其GUS的瞬時表達效率最高，為75.36%；經PCR和RT-PCR檢測，得到抗性植株的陽性率為3%。盡管如此，由于存在轉化效率低、穩定性差等因素，農桿菌介導的遺傳轉化法在葡萄風信子基因工程研究中尚未得到高效利用。因此，對已有研究結果進行整合優化，建立一套高效可用的葡萄風信子愈傷組織遺傳轉化體系以用于基因功能的解析，具有重要的實踐意義。

草地學報第31卷第4期田淑婷等：農桿菌介導的葡萄風信子愈傷組織遺傳轉化體系的優化本研究在綜合前人研究結果及潮霉素敏感性試驗的基礎上，比較不同基因型、農桿菌菌株、愈傷來源、培養方式及不同超聲處理功率對GUS瞬時轉化效率的影響，旨在優化葡萄風信子愈傷組織遺傳轉化體系，為在葡萄風信子中快速有效地開展基因功能的深入研究提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料供試材料葡萄風信子亞美尼亞（M. armeniacum）、‘黑眼睛’（M. aucheri ‘Dark Eyes’）栽種于西北農林科技大學林學院苗圃中，于4月盛花期采取葉片和花蕾，經75%酒精30 s和10%次氯酸鈉10 min消毒后切成1 cm左右的小段，接種于愈傷誘導培養基上進行愈傷組織的誘導。愈傷誘導培養基配方為4.43 g·L^-1MS+30 g·L^-1蔗糖+3 g·L^-1植物凝膠+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.1 mg·L^-16-BA，pH = 5.8～6.0。每隔15 d更換一次培養基，45 d后將誘導的愈傷組織分別置于固體或液體的相同培養基中繼代保存。

1.1.2菌株與載體菌株為根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105和GV3101，感受態購自北京全式金生物技術有限公司。載體pCAMBIA1304由本實驗室保存，其T-DNA區段上攜帶GUS（β-gulcuronidase）報告基因和潮霉素磷酸轉移酶基因（Hyg）作為選擇標記基因。

1.2試驗方法

1.2.1葡萄風信子愈傷組織潮霉素敏感性試驗選取1 g生長狀態一致的亞美尼亞和‘黑眼睛’的葉源（黃色顆粒狀）和花源（淡黃松散狀）愈傷組織，分別轉入含不同潮霉素（Hygromycin，Hyg）濃度的愈傷誘導培養基上（0，90，120，150，180 mg·L^-1），于24℃黑暗條件下培養，35 d后統計愈傷組織的鮮重變化和生長狀況。每處理重復3次。

1.2.2根癌農桿菌菌液的準備pCAMBIA1304載體經凍融法分別轉化根癌農桿菌EHA105和GV3101。取200 μL菌液，置于5 mL含50 mg·L^-1 Kan，25 mg·L^-1 Rif的液體LB培養基中，28℃，180 r·min^-1搖床上振蕩培養過夜。后于離心機中5 000 r·min^-1離心10 min，棄上清，用制備好的重懸液將菌體重懸，調OD600至0.5。28℃，180 r·min^-1避光振蕩培養1～2 h。

重懸液配方：4.43 g·L^-1MS+30 g·L^-1蔗糖+10 mol·L^-1 MES+100 μmol·L^-1 AS+0.1% Tween20，pH為5.8～6.0。

1.2.3不同基因型和農桿菌菌株對GUS瞬時轉化效率的影響將經固體培養的亞美尼亞和‘黑眼睛’的花源愈傷組織分別加入含50 mL無菌水的三角瓶中，置于超聲波清洗儀中，80%（500 W），3 min。后分別加入制備好的重懸菌液，震蕩侵染20 min，無菌濾紙吸干表面菌液，接種于預先配置好的共培養基上。于24℃黑暗條件下共培養4 d。每處理重復3次。

共培養基配方：4.43 g·L^-1MS+30 g·L^-1蔗糖+3 g·L^-1植物凝膠+1.0 mg·L^-12，4-D+0.1 mg·L^-16-BA+10 mmol·L^-1 MES+100 μmmol·L^-1 AS+0.1% Tween20，pH為5.8～6.0。

1.2.4不同愈傷來源和培養方式對GUS瞬時轉化效率的影響將經固體培養和液體培養后的亞美尼亞葉源愈傷組織和花源愈傷組織分別加入含50 mL無菌水的三角瓶中，置于超聲波清洗儀中，80%（500 W），3 min。后加入制備好的重懸菌液pCAMBIA1304-GV3101，侵染及共培養方式同上。每處理重復3次。

1.2.5不同超聲處理功率對GUS瞬時轉化效率的影響將經液體培養的亞美尼亞花源愈傷組織加入含50 mL無菌水的三角瓶中，置于超聲波清洗儀中，分別于不同功率60%～100%（500 W）下超聲處理3 min。后加入制備好的重懸菌液pCAMBIA1304-GV3101，侵染及共培養方式同上。每個處理重復3次。

1.2.6脫菌及篩選培養共培養結束后，將愈傷組織轉至含300 mg·L^-1Carb的抗生素水中震蕩10 min，后用無菌水震蕩清洗3～5次，濾紙吸干后接種至篩選培養基中，于24℃，3000 lux光下進行篩選培養。每15～20 d繼代一次，至新的抗性愈傷長出。

篩選培養基配方：4.43 g·L^-1MS+30 g·L^-1蔗糖+3 g·L^-1植物凝膠+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.1 mg·L^-1 6-BA+300 mg·L^-1Carb+150 mg·L^-1Hyg，pH=5.8～6.0。

1.2.7GUS瞬時表達的組織化學測定共培養結束后，從各處理中分別稱取1 g脫菌的愈傷組織于離心管中，并加入10 mL GUS染液使其完全浸沒，于37℃培養箱中避光培養24～36 h。培養結束后用75%的酒精進行脫色，至陰性對照完全無色時記錄GUS的瞬時染色情況。每組處理各重復3次。GUS染液參照Jefferson等的方法配制。

根據染色程度，將愈傷組織劃分為4個等級：未染色（-）、染色較淺（+）、染色適中（++）、染色較深（+++）。體式顯微鏡下的著色情況如圖1所示。

1.2.8轉化愈傷組織的PCR和RT-PCR檢測采用CTAB法提取愈傷組織DNA。依據RNA提取試劑盒（美國Omega公司）和反轉錄試劑盒（艾科瑞生物科技有限公司）的使用說明，提取愈傷組織的RNA，并反轉錄得到cDNA。

以抗性愈傷組織的DNA或cDNA為模板，對GUS基因的插入及轉錄情況進行PCR和RT-PCR檢測，PCR引物如表1所示（擴增片段大小為557 bp）。反應體系及程序設置參照2×Taq Master mix使用說明。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像儀下觀察并拍照。

2結果與分析

2.1葡萄風信子愈傷組織潮霉素敏感性試驗

由圖2可知，亞美尼亞葉源（圖2A）和花源（圖2B）愈傷組織對潮霉素的敏感性均較弱。潮霉素濃度為90～150 mg·L^-1時，愈傷組織生長速度出現了不同程度的減緩。當潮霉素濃度高于150 mg·L^-1時，亞美尼亞葉源和花源愈傷組織均停止生長并出現輕微的褐化現象，35 d后測得的愈傷組織鮮重低于初始值1 g。因此，潮霉素濃度150 mg·L^-1可以作為亞美尼亞葉源和花源愈傷組織篩選的臨界濃度。

圖3可知，‘黑眼睛’葉源（圖3A）和花源（圖3B）愈傷組織對潮霉素的敏感性稍強于亞美尼亞。潮霉素濃度為90～120 mg·L^-1時，愈傷組織生長速度出現了顯著的減緩。當潮霉素濃度高于120 mg·L^-1時，‘黑眼睛’葉源和花源愈傷組織均停止生長并出現輕微的褐化現象，35 d后測得的愈傷組織鮮重低于初始值1 g。因此，潮霉素濃度120 mg·L^-1可以作為‘黑眼睛’葉源和花源愈傷組織篩選的臨界濃度。

2.2葡萄風信子愈傷組織遺傳轉化

葡萄風信子愈傷組織轉化的過程如圖4所示。選取生長健壯植株的葉或花誘導獲得愈傷組織（圖4A-C），于無菌水中進行超聲預處理后加入制備好的重懸菌液震蕩侵染（圖4D），并于共培養基上避光培養（圖4E）。4 d后脫菌并取部分愈傷組織進行GUS染色（圖4F），其余轉移至篩選培養基上進行轉化愈傷組織的篩選（圖4G）。1個月左右愈傷組織開始褐化，約2個月后待新的抗性愈傷組織產生后（圖4H），將其轉移至新的篩選培養基中繼代培養（圖4I）。

2.2.1不同基因型和農桿菌菌株對GUS瞬時轉化效率的影響表2可知，亞美尼亞和‘黑眼睛’的花源愈傷組織在2種農桿菌菌株GV3101和EHA105侵染時均能獲得較高的GUS瞬時轉化效率，且各處理間未表現出顯著差異。其瞬時轉化效率分別為（85.59±7.09）%，（85.01±7.85）%及（81.94±6.03）%，（84.64±3.09）%。而其中，亞美尼亞的愈傷組織在2種農桿菌侵染時著色更深，分別有（33.74±6.40）%和（44.93±3.17）%表現為中等著色，（13.89±4.94）%和（13.51±3.63）%表現為強的著色；而‘黑眼睛’僅有（14.54±1.96）%和（19.73±2.56）%表現中等著色，（13.66±3.51）%和（14.49±4.41）%表現強的著色。因此，確定葡萄風信子遺傳轉化的最適基因型為亞美尼亞，但二者整體差異不顯著。而GV3101和EHA105均可作為葡萄風信子遺傳轉化的適宜菌株。

2.2.2不同愈傷來源和培養方式對GUS瞬時轉化效率的影響表3可知，經固體和液體培養的亞美尼亞葉源和花源愈傷組織的GUS瞬時轉化效率有較大差異，表現為液體培養的花源愈傷gt;固體培養的花源愈傷gt;液體培養的葉源愈傷組織gt;固體培養的葉源愈傷組織。經液體培養的花源愈傷組織瞬時轉化效率最高，可達（98.73±0.67）%。同時，液體培養的花源愈傷組織著色最深，分別有（68.12±4.65）%和（15.52±2.26）%表現為中等或強的著色。經固體培養的葉源愈傷組織瞬時轉化效率最低，為（73.72±6.87）%，且其愈傷組織著色最淺，僅有（13.62±4.86）%和（2.74±0.02）%的愈傷組織表現為中等或強的著色。而經液體培養的葉源愈傷組織和經固體培養的花源愈傷組織在本次試驗中的瞬時轉化效率未表現出顯著差異，分別為（86.08±4.50）%和（90.00±4.00）%。其中，固體培養的花源愈傷組織表現出更深的著色，有（35.62±3.47）%和（10.85±4.51）%表現為中等或強的著色，而液體培養的葉源愈傷組織僅為（14.19±7.25）%和（3.22±4.55）%。因此，經液體培養的花源愈傷組織可作為葡萄風信子遺傳轉化最優的愈傷來源和培養方式。

2.2.3不同超聲處理功率對GUS瞬時轉化效率的影響表4可知，不同超聲功率處理下的亞美尼亞花源愈傷組織的GUS瞬時轉化效率均較高，且各處理之間未表現出顯著差異。其最高瞬時轉化效率達（97.95±2.78）%。因此，無須超聲處理即可作為葡萄風信子遺傳轉化的適宜方式。

2.3轉化愈傷組織的PCR和RT-PCR檢測

試驗最終獲得209塊抗性愈傷組織，隨機抽選30塊進行轉化愈傷組織的分子檢測。結果顯示，有27塊擴增出了557 bp的目的片段，陽性率可達90%。而未轉化的愈傷組織中沒有檢測到目的片段的存在。該試驗結果初步表明，目的片段已成功整合到葡萄風信子愈傷組織的基因組DNA中，并成功實現了目的片段的轉錄。部分抗性愈傷的PCR和RT-PCR擴增情況如圖5，圖6所示。

3討論

高效的遺傳轉化體系在植物基因功能研究和新品種選育等方面有著至關重要的作用。其中農桿菌的侵染、植物的應答以及轉化細胞的再生等因素均會對其轉化效率產生影響［17］。以往葡萄風信子的研究多集中在轉化過程中，對轉化受體的優化研究較少，且各研究間較為獨立，相關結論尚未得到整合利用。因此，本試驗綜合利用前人研究結果，并在此基礎上完成進一步的優化。

為了成功實現植物遺傳轉化，需要建立一套高效穩定的受體體系。不同篩選標記及其臨界濃度的選擇對于遺傳轉化的效率和植株再生有著重要的影響。過高濃度的篩選抗生素導致植物細胞的損傷，濃度過低則無法有效的篩選轉化細胞［18-19］。Suzuki等［20］研究了幾種篩選及抑菌抗生素對葡萄風信子‘藍珍珠’胚性愈傷組織生長和體胚發生的影響。得到愈傷組織潮霉素篩選的臨界濃度為75 mg·L^-1，而卡那霉素對愈傷和體胚的抑制作用較??；張海芹［21］在研究對葡萄風信子亞美尼亞愈傷組織的抗生素臨界濃度進行篩選時發現，愈傷組織的潮霉素致死濃度為210 mg·L^-1。本試驗確定了亞美尼亞葉源和花源愈傷組織潮霉素的適宜濃度為150 mg·L^-1。與張海芹［21］的結果存在一定差異，可能與處理時愈傷組織的生長狀態及接種方式有關。植物遺傳轉化效率取決于植株對農桿菌侵染的敏感性，不同基因型對不同農桿菌菌株的敏感程度存在不同［22］。在本試驗中，2種不同菌株GV3101和EHA105對亞美尼亞和‘黑眼睛’愈傷組織的瞬時轉化效率影響并不顯著，其遺傳轉化均較為容易，表明該體系對葡萄風信子具有廣泛的適用性。此外，轉化受體的生長狀態對轉化效率也有重要的影響。研究表明，活躍松散的愈傷組織通常能獲得更高的遺傳轉化率［22-23］。Suzuki等［14］比較了幾種受體類型對葡萄風信子‘藍珍珠’轉化效率的影響，表明以胚性培養物為轉化受體優于葉、根、鱗莖和花梗的可能原因是胚性培養物具有較高的細胞分裂活性而有利于接受外源基因的轉化。Cohen等［24］發現經液體培養得到的麝香百合（Lilium longiflorum）和圣星百合（Ornithogalum dubium）的松散愈傷組織的瞬時轉化效率是固體培養的50～70倍。本研究也呈現出相似的結果。在前期試驗中發現，不同愈傷來源和培養方式下的愈傷組織在生長狀態和增殖速度等方面表現出顯著的差異。液體培養的花源愈傷組織較為疏松活躍的狀態更有利于瞬時轉化效率的提高，這可能是其較高的分生能力有利于農桿菌的侵染。此外，初代培養的花源愈傷組織在轉化時具有更高的GUS染色率，呈現較深的著色。繼代半年后，葉源和花源愈傷組織間的差異隨愈傷組織生長狀態的接近而逐漸縮小，且愈傷組織的侵染效率也隨著生長的減緩而逐漸降低（數據未顯示）。負壓和超聲處理是遺傳轉化中兩種常用的造傷處理方法，適宜程度的機械損傷有利于促進農桿菌的侵入，從而提高植株的轉化效率［25-26］。本試驗中，超聲處理對愈傷組織的轉化效率影響較小，經液體培養的花源愈傷組織無需超聲處理即可獲得較高的瞬時轉化效率。優化后遺傳轉化體系將瞬時遺傳轉化效率提高至（98.73±0.67）%，同時獲得的抗性愈傷組織的陽性率也得到了顯著的提升，高達90%。

傳統的遺傳轉化往往依賴于高效的植株再生體系，實驗周期長，操作難度大［27］。近年來，人們利用轉化愈傷組織的表型變化直接進行色素、抗性等相關基因功能的鑒定，獲得了較好的成效［28-32］。因此，如何利用優化后的體系更為高效地開展葡萄風信子基因功能的鑒定，尚需進行進一步的探索。

4結論

本研究建立了一種高效的根癌農桿菌介導的葡萄風信子愈傷組織遺傳轉化體系。利用該體系獲得的最高瞬時轉化效率為98.73%，并成功獲得了轉基因愈傷組織。優化后的體系為在葡萄風信子中高效進行基因功能的研究提供技術支持，為葡萄風信子的分子改良育種提供參考。

參考文獻

［1］LOU Q，LIU Y L，QI Y Y，et al. Transcriptome sequencing and metabolite analysis reveals the role of delphinidin metabolism in flower colour in grape hyacinth［J］. Journal of experimental botany，2014，65（12）：3157-3164

［2］呂文濤，婁曉鳴，趙雨菲. 葡萄風信子物候期觀察與觀賞性狀分析［J］. 安徽農業科學，2021，49（14）：50-53

［3］WANG S，YANG F M，JIU L J，et al. Plant regeneration via somatic embryogenesis from leaf explants of Muscari armeniacum［J］. Biotechnology amp; Biotechnological Equipment，2013，27（6）：4243-4247

［4］BOKOV D O. Muscari armeniacum Leichtlin （grape hyacinth）：phytochemistry and biological activities review［J］. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research，2019，12（1）：68-72

［5］QI Y Y，LOU Q，LI H B，et al. Anatomical and biochemical studies of bicolored flower development in Muscari latifolium［J］. Protoplasma，2013，250（6）：1273-1281

［6］LOU Q，WANG L，LIU H L，et al. Anthocyanin profiles in flowers of Grape Hyacinth［J］. Molecules，2017，22（5）：688-697

［7］CHEN K L，LIU H L，LOU Q，et al. Ectopic expression of the Grape Hyacinth （Muscari armeniacum） R2R3-MYB transcription factor gene，MaAN2，induces anthocyanin accumulation in Tobacco［J］. Frontiers in Plant Science，2017，8（1）：965-978

［8］CHEN K L，DU L J，LIU H L，et al. A novel R2R3-MYB from grape hyacinth，MaMybA，which is different from MaAN2，confers intense and magenta anthocyanin pigmentation in tobacco［J］. BMC Plant Biology，2019，19（1）：390-405

［9］ZHANG H，GONG J X，CHEN K L，et al. A novel R3 MYB transcriptional repressor，MaMYBx，finely regulates anthocyanin biosynthesis in grape hyacinth［J］. Plant Science，2020，298：110588

［10］葉文興，孔令琪. 影響根癌農桿菌轉化效率的因素綜述［J］. 中國草地學報，2019，41（3）：142-148

［11］張瑜，鄢家俊，白史且，等. 農桿菌介導禾本科植物遺傳轉化的研究進展［J］. 草業與畜牧，2016（4）：4-9

［12］馬旭，張銘芳，肖偉，等. 百合遺傳轉化及納米磁珠法研究進展［J］. 分子植物育種，2020，18（14）：4657-4664

［13］易雙雙，陸順教，楊光穗，等. 蘭花遺傳轉化技術研究進展［J］. 北方園藝，2016（20）：187-194

［14］SUZUKI S，NAKANO M. Agrobacterium-mediated production of transgenic plants of Muscari armeniacum Leichtl. ex Bak［J］. Plant Cell Reports，2002，20（9）：835-841

［15］許勝. 花色基因Delila轉化葡萄風信子的研究［D］. 楊凌：西北農林科技大學，2007：26-34

［16］張海芹，劉雅莉，張鋒，等. 根癌農桿菌介導的葡萄風信子遺傳轉化體系［J］. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2017，45（2）：135-142

［17］葉興國，王新敏，王軻，等. 提高植物農桿菌轉化效率輔助策略研究進展［J］. 中國農業科學，2012，45（15）：3007-3019

［18］陳蘭，朱晨，李小楨，等. 茶樹遺傳轉化體系研究進展［J］. 安徽農業科學，2019，47（12）：14-18，23

［19］李俊，溫紅雨，高洪文，等. 東方山羊豆GoGID基因表達載體構建及紫花苜蓿轉化［J］. 草地學報，2015，23（1）：167-172

［20］SUZUKI S，NAKANO M. Effects of antibiotics and bialaphos on the growth and development of embryogenic callus cultures of Muscari armeniacum［J］. Biologia Plantarum，2003，47（3）：425-427

［21］張海芹. 農桿菌介導的葡萄風信子遺傳轉化體系建立的研究［D］. 楊凌：西北農林科技大學，2016：10-33

［22］楊柳，于翠梅，劉銘，等. 影響農桿菌轉化的植物因素研究進展［J］. 分子植物育種，2018，16（23）：137-142

［23］鮑睿，史文靜，王躍進. 無核白葡萄愈傷組織瞬時轉化體系的優化與應用［J］. 西北植物學報，2017，37（4）：654-664

［24］COHEN A，LIPSKY A，ARAZI T，et al. Efficient genetic transformation of Lilium longiflorum and Ornithogalum dubium by particle acceleration followed by prolonged selection in liquid medium［J］. Acta Horticulturae，2004，651（651）：131-138

［25］張潔，周巖. 根癌農桿菌轉化單子葉植物的研究進展與對策［J］. 生物技術通報，2013，8（5）：7-14

［26］張麗君，程林梅，杜建中，等. 農桿菌介導普那菊苣遺傳轉化體系的建立［J］. 草地學報，2011，19（6）：1042-1050

［27］LOU Q，LIU H L，LUO W，et al. Creating a novel petal regeneration system for function identification of colour gene of grape hyacinth［J］. Plant Methods，2021，17（1）：94-104

［28］ZHOU L J，LI Y Y，ZHANG R F，et al. The small ubiquitin-like modifier E3 ligase MdSIZ1 promotes anthocyanin accumulation by sumoylating MdMYB1 under low-temperature conditions in apple［J］. Plant Cell and Environment，2017，40（10）：2068-2080

［29］LU S W，ZHANG Y，ZHU K J，et al. The citrus transcription factor CsMADS6 modulates carotenoid metabolism by directly regulating carotenogenic genes［J］. Plant Physiology，2018，176（4）：2657-2676

［30］BAI S L，TAO R Y，TANG Y X，et al. BBX16，a B-box protein，positively regulates light-induced anthocyanin accumulation by activating MYB10 in red pear［J］. Plant Biotechnology Journal，2019，17（10）：1985-1997

［31］BAI S L，TAO R Y，YIN L，et al. Two B-box proteins，PpBBX18 and PpBBX21，antagonistically regulate anthocyanin biosynthesis via competitive association with Pyrus pyrifolia ELONGATED HYPOCOTYL 5 in the peel of pear fruit［J］. Plant Journal，2019，100（6）：1208-1223

［32］WANG N，QU C Z，WANG Y C，et al. MdMYB4 enhances apple callus salt tolerance by increasing MdNHX1 expression levels［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2017，131（2）：283-293

（責任編輯 彭露茜）