達烏里胡枝子四株耐鹽堿根際促生菌的鑒定及其促生作用

摘要：挖掘耐鹽堿菌種和研發生物改良制劑是治理退化鹽堿草地和開發利用鹽堿荒地的重要途徑。本研究通過形態學、生理生化和分子生物學手段對菌株進行鑒定，測定不同鹽堿濃度下液體培養基其菌株濃度，功能性培養基測定其促生特性，定量測定其促生產物；紙培養基法驗證菌株對達烏里胡枝子（Lespedeza daurica）、燕麥（Avena sativ）、紫花苜蓿（Medicago Sativa）及小黑麥（Triticum aestivum）種子生長的影響，旨在對DP12，DP15，DP28和DP29進行促生性分析。DP12，DP29初步鑒定為Enterobacter hormaechei，DP15為Serratia fonticola，可在7%鹽濃度或pH12條件下生長。4株菌有溶磷、產IAA和有機酸能力；DP15，DP29有解鉀能力；DP12，DP15，DP29可固氮和分泌鐵載體。DP12，DP15，DP29可促進達烏里胡枝子、小黑麥和燕麥生長及鮮重的增加；DP28可促進達烏里胡枝子和燕麥生長和鮮重的增加；DP12和DP28對苜蓿具有促生作用。4株根際細菌為中度耐鹽菌，兼具多重促生特性，為后期開發牧草專用生物改良制劑提供了菌種資源，有助于開發Enterobacter sp及Staphylococcus sp微生物在生物改良制劑方面的潛能。

關鍵詞：黃土高原；根際細菌；豆科；禾本科；耐鹽堿；促生特性

中圖分類號：S156.4文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）04-1036-12

Identification and Plant Growth Promotion Analysis of Four Salt-alkali Tolerant

Rhizosphere-promoting Bacteria Isolated from Lespedeza daurica

HUANG Chen， HAN Ling-juan， LIANG Yin-ping， YANG Kai-yuan， JIANG Lin， SUN Xiao-han，

FAN Le， ZHAO Xiang GAO Peng

（College of grassland science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：Unearthing the salt-tolerant strains to develop the biological improvement agents are important ways to restore the degraded saline-alkali grassland and explore the saline-alkali wasteland be usable. DP12，DP15，DP28，DP29 were identified by morphological observation，physiological and biochemical measurements，and 16S rRNA gene sequencing analysis. The liquid mediums with different salt-alkali concentration （salt concentration was 0%，1%，3%，5%，and 7%，and the pH was 7，8，9，10，11，and 12） were used to test their saline-alkali tolerance. The functional mediums were used to measure their growth-promoting function. Meanwhile，the catalyst was quantitatively determined. The petri dish filter paper method was used to verify the effects of the strain on the germination of the seeds of Lespedeza daurica，Medicago Sativa，Triticum aestivum and Avena sativa. In order to screen out the dominant rhizosphere with growth promoting functions，the strains DP12 and DP29 were identified to be E. hormaechei，the strain DP15 was S. fonticola，the strain DP29 was S. epidermidis. All of the strains above was able to survive at the salt concentration of or less than 7%，at pH of 8～12. Through the growth-promoting function research，it was found out that all four strains had an ability to produce auxin and organic acids. Among them，the strains DP15 and DP29 had an ability to release potassium，the strains DP12，DP15 and DP29 had an ability to nitrogen fixation and produce siderophores. Strains DP12，DP15，DP29 significantly promoted the stem growth，root development and fresh weight of L. daurica，T. aestivum and A. sativa. The Strain DP28 significantly promoted the stem growth，root development and fresh weight of L. daurica and A. sative. The strains DP12 and DP28 significantly promoted the root development of M. sativa. The four strains of rhizosphere bacteria belong to moderate salt-tolerant bacteria and have multiple growth-promoting characteristics，which provide efficient and bacterial resources for the development of special biological improvement agents for L. daurica，M. Sativa， T. aestivum and A. sativa，and help to realize the potential of Enterobacter and Staphylococcus for the developments of biological improvement agents.

Key words：Loess plateau;Rhizosphere bacteria;Leguminosae;Gramineae family;Saline-alkaline tolerance;Plant growth-promoting property

土壤鹽堿化是制約農業生產、威脅生態安全的重大災害性問題，改變土壤的生理生化特性，影響植物幼苗根系形態的建成，進而抑制植物生長［1］。此外，土壤鹽分逐漸累積，易造成土壤板結，減少植物對水分的吸收，降低植物的生產力。目前，鹽漬土地的治理主要通過節水灌溉、淋洗、土壤深翻和化學手段（添加改良劑，例如石膏、CaCl2等）等方法，這些存在經濟成本高、見效慢等問題［2］。根際促生菌（Plant growth-promoting bacteria，PGPB）是定殖在植物根際并促進植物生長發育、提高植物抗性功能的一類有益細菌［3］，可通過分泌鐵載體、有機酸等增強植物對鹽堿、重金屬和病害等逆境的抗性［4］。耐鹽微生物可以在滲透脅迫和離子脅迫條件下生存，部分菌株在緩解生物脅迫和非生物脅迫對植物的傷害中發揮重要作用［2］。Ranawat等［5］從古吉拉特邦的鹽水中分離出的霍氏腸桿菌MF957335顯著提高了番茄產量，并增強其耐鹽性和抗病性。Shahid等［6］從甘草根際分離出3株葡萄球菌，能夠減輕鹽堿脅迫對玉米植株的氧化損傷，從而促進玉米的生長。Becze等［7］發現在低鹽脅迫下，居泉沙雷氏菌Bb17顯著提高了玉米生物量。Etesami等［8］發現同時接種溶磷微生物及叢生菌根真菌可緩解紫花苜蓿鹽脅迫，促進植物生長，改善植物品質?？梢?，耐鹽堿促生菌對緩解植物鹽脅迫和促進植物生長具有重要意義。此外，植物-微生物互作受到土壤環境的影響，例如土壤溫度、鹽度、養分、pH等［9-10］。土壤低溫、高溫是重要的非生物脅迫因子，極大的限制了植物的生長發育和微生物的繁殖［9］。牧草主要種植區位于我國北方，地域跨度大，溫度及土壤環境差異大，因此，耐受能力強的根際促生菌株具有更加廣泛的應用前景。

達烏里胡枝子為豆科（Leguminosae）胡枝子屬（Lespedeza）的多年生草本狀半灌木，是黃土高原地區改良退化草地、修復礦區的主要鄉土草種之一，同時也是優良的青飼料［11］。達烏里胡枝子可在pH為8.6，土壤水溶性鹽總量為5.33 g·kg-1的環境中生長，根際微生物菌群可能是提高其耐鹽堿能力的重要途徑之一。因此，對達烏里胡枝子根際有益微生物進行挖掘具有重要的意義。此外，隨著草食畜牧業集約化發展步伐的加快，優質牧草需求量在不斷增加，牧草品質不佳及產量低等問題逐漸凸顯。而我國牧草種植區多集中于北方半干旱，干旱地區，且多為鹽堿地、坡地等，嚴重影響燕麥、小黑麥及苜蓿等牧草的生長，極大的制約著我國飼草產業發展及畜牧產業壯大。

鑒于此，本研究以不同種植年限達烏里胡枝子種植田土壤中分離篩選到的4株根際細菌DP12，DP15，DP28和DP29［12］為材料，進行了進行一系列生理生化及分子生物學鑒定、促生機理的初步研究，進一步通過菌株接種于達烏里胡枝子、燕麥、小黑麥、苜蓿上驗證其促生效果，以期為開發牧草生物改良制劑提供菌種資源。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗菌種、試驗種子獲取菌株DP12，DP15，DP29和DP28（Staphylococcus epidermidis，GenBank登錄號：ON077032）由山西農業大學草業學院提供，菌株DP12和DP29分離自種植兩年達烏里胡枝子根際，菌株DP15和DP28分離自種植一年達烏里胡枝子根際。

‘晉農一號’達烏里胡枝子種子、‘WL-525’紫花苜蓿種子、‘冀農一號’小黑麥種子、‘太陽神’燕麥種子由山西農業大學草業學院保存。

1.1.2主要試劑及儀器Salkowski比色液：濃H₂SO₄ 150 mL，7.5 mL濃度為0.5 mol·L^-1的FeC1₃，無菌水250 mL。化學試劑均為分析純。

菌懸液制備：供試菌株在LB液體培養基中活化培養12 h后，室溫10 000 rpm離心5 min，收集菌體，反復重懸3次，菌體重新懸浮于無菌水中，通過無菌水稀釋至OD₆₀₀值約為0.1，0.5和0.8。

儀器：培養基分裝器，重慶江雪科技有限公司；光學顯微鏡，日本Olympus公司；振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；渦旋儀，大龍興創實驗儀器有限公司。

1.2達烏里胡枝子根際細菌的鑒定

1.2.1菌落形態與特征觀察將待試菌株接種于LB固體培養基，28℃、黑暗培養3 d，觀察并記錄單菌落各項形態特征，包括顏色、大小、表面質地、透明度和邊緣形狀等。

1.2.2生理生化鑒定對待測菌株進行明膠液化、淀粉水解、甲基紅試驗、芽孢染色、過氧化氫酶反應測定［13］。接種菌懸液（接種量1%，OD600≈0.1）于唯一碳源培養基中（甘露醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉），振蕩培養56 h后觀察菌株生長情況（28℃、180 r·min^-1、黑暗）［14］。

1.2.3菌株分子鑒定使用20 μL移液槍頭沾取少量菌液，置于盛有20 μL無菌水的PCR八連排管中進行PCR擴增，通用引物采用27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），PCR反應體系（50 μL）為2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物（10 μmol·L^-1）各2 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O19 μL。PCR反應程序為94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環30次；最后72℃延伸5 min。擴增產物送生工生物工程上海股份有限公司測序。將測得的16S rRNA基因序列在NCBI數據庫中注冊，獲得登錄號。使用MEGA X軟件將序列與EZBioCloud數據庫（https：//www.ezbiocloud.net/identify）中的相近模式菌株的序列進行系統發育分析，采用鄰接法（Neighbor-Joining method）構建系統發育樹，自展值（bootstrap）為1 000次。

1.2.4菌株生長曲線的測定接種5 mL的菌懸液（OD₆₀₀≈0.1）于盛有100 mL LB液體培養基的三角瓶中，30℃、180 r·min^-1恒溫震蕩培養30 h，每隔2 h監測一次OD₆₀₀值，記錄直至測到30 h，并繪制生長曲線圖。

1.3菌株耐受高低溫及耐鹽堿能力測定

將活化的待測菌株接種于LB固體培養基，分別倒置于4℃，20℃，28℃，37℃細菌培養箱中，每組3次重復，于4 d后觀察、記錄細菌生長情況。

參考柳鑫鵬等［15］方法制備不同鹽堿梯度培養基，吸取4 μL待測菌株菌懸液（OD600≈0.1）轉移到盛有196 μL不同鹽堿梯度（pH值為7，8，9，10，11，12，培養基鹽濃度為1%；NaCl濃度為0%，1%，3%，5%，7%，pH為7）液體培養基的96孔板中，每組3次重復，28℃、180 r·min^-1培養，對照加入等量的蒸餾水，每隔4 h測定OD₆₀₀值，并記錄，每組重復3次，繪制生長曲線圖。

1.4達烏里胡枝子根際細菌功能特性測定

1.4.1溶磷、固氮、解鉀能力測定將活化的待測菌株接種于蒙金娜有機磷固體培養基上，黑暗、28℃培養，每組5次重復，于7 d后觀察透明圈產生情況。采取十字交叉法測定透明透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），并計算D/d值。

吸取1 mL懸浮菌液（OD₆₀₀≈0.8）接種于盛有60 mL蒙金娜有機磷液體培養基的三角瓶中，接種無菌水為對照，每組3次重復。置于28℃、180 r·min^-1振蕩培養箱培養5 d，后渦旋儀上混勻5 min，取10 mL混勻的培養液，10 000 r·min^-1高速離心15 min，采用“鉬銻抗比色法”測定上清液有效磷含量，并測定上清液的pH值［16］。

將菌株點接種于解鉀固體培養基上，每株菌重復3次，28℃、恒溫培養5 d，觀察菌株周圍是否出現透明圈，有透明圈則表明具有解鉀能力，并通過十字交叉法測定暈圈及菌落大小。

將待測菌株接種于NFM固體培養基上，28℃、恒溫培養10 d，連續轉接3次，在NFM培養基上可生長的待測菌株則被視為具有固氮能力［17］。

1.4.2達烏里胡枝子根際細菌產鐵載體能力測定將待測菌株點接種于CAS固體培養基上，每株菌重復3次，28℃、恒溫培養5 d，觀察菌株周圍是否出現橙色鐵載體暈圈，有橙色暈圈為產鐵載體菌株。

將0.5 mL菌懸浮液（OD₆₀₀≈0.5）接種于盛有50 mL MKB液體培養基的錐形瓶中，每組重復3次，28℃、180 r·min^-1振蕩培養箱培養2 d。培養結束后，取適量發酵液10 000 r·min^-1離心10 min，取3 mL上清液與等體積CAS檢測液充分混勻，避光靜置30 min，測定OD₆₃₀值（As），測定未接種的MKB液體培養基OD6₃₀值（Ar），用相對鐵載體活性單位表示（Siderophore units，SU）［18］。

1.4.3達烏里胡枝子根際細菌產生長素（Indole-3-Acetic Acid，IAA）能力測定將分離純化后的菌株接種于L-色氨酸（0.2 g·L^-1）的KMB液體培養基中，30℃、180 r·min^-1條件下震蕩培養48 h，10 000 r·min^-1離心10 min，取3 mL上清液與等體積Salkowski比色液充分混合，以未接菌培養基為對照，避光靜置30 min，顏色變粉紅為具有產IAA能力菌株，并在OD530測定發酵液中IAA含量［19］。

1.4.4達烏里胡枝子根際細菌產有機酸能力測定將供試菌株在以溴甲酚紫為指示劑的固體培養基上進行接種，28℃、恒溫培養3 d，每組重復3次，出現橙黃色暈圈表明菌株具有有機酸分泌能力，并通過十字交叉法測定暈圈及菌落大小。

1.5達烏里胡枝子根際細菌促生試驗

挑選成熟飽滿的達烏里胡枝子和苜蓿種子，10%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無菌水沖洗至無味。設置5個處理，A處理：將種子置于盛有待測菌菌懸液（OD₆₀₀≈0.5）中無菌培養皿中浸泡12 h；B處理（無菌水對照）：將種子置于盛有無菌水的無菌培養皿中浸泡12 h。取出晾干種子表面水分，置于裝有兩層無菌濾紙的培養皿中，每皿50 粒種子，每個處理4次重復，置于光照培養箱中，發芽條件為25℃（16 h，光照，12 000 Lux）/20℃（8 h，暗培養），5 d后統計苜蓿根長、莖長、苗長及其干鮮重；14 d后統計達烏里胡枝子根長、莖長、苗長、發芽率及其干鮮重，14 d后統計達烏里胡枝子發芽率。

根際細菌對黑麥、燕麥種子幼苗促生試驗：挑選成熟飽滿的小黑麥和燕麥種子，10%次氯酸鈉溶液消毒5 min，無菌水沖洗至無味。設置5個處理，A處理：種子置于盛有各待測菌菌懸液（OD600≈0.5）的無菌培養皿中浸泡12 h；B處理（無菌水對照）：置于盛有無菌水的無菌培養皿中浸泡12 h。取出晾干種子表面水分，置于裝有兩層無菌濾紙的培養皿中，每皿20 粒種子，每組4次重復，置于光照培養箱中，發芽條件為20℃，12 000 Lux（8 h光照/16 h黑暗），5 d后統計小黑麥和燕麥幼苗的最長須根長度、莖長、苗長、須根數、其他須根平均長度及其干鮮重。

1.6數據分析

利用Microsoft Excel 2019整理數據，使用SPSS 20.0進行數據分析，對達烏里胡枝子發芽率、達烏里胡枝子、苜蓿、小黑麥及燕麥干鮮重、主根長度、株高、苗長和小黑麥及燕麥最長須根長度、其他須根長度、須根數進行單因素方差分析和最小顯著差法（LSD法）多重比較（Plt;0.05）。

2結果與分析

2.1達烏里胡枝子根際細菌菌種鑒定

菌株DP12，DP15和DP29菌體形態均呈短桿狀，菌株DP28菌體形態均呈球狀（圖1）。

2.2菌株生理生化特性

生理生化特征可以反映菌株的本質特征與特性，是鑒別微生物種類的重要途徑和依據之一。對所篩菌株進行革蘭氏染色、甲基紅反應、接觸酶試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、芽孢染色等特性檢測，結果見表2。

2.3 16S rRNA基因分子鑒定

菌株DP12（GenBank登錄號：OP413041）、DP15（GenBank登錄號：OP413042）、DP28（GenBank登錄號：ON077032）和DP29（GenBank登錄號：OP413043）的16S rDNA序列長度分別為1 451，1 447，1 459和1 445 bp。通過EZBioCloud數據庫比對和系統發育樹分析（圖5），DP12與DP29聚為一類，與現有模式菌株霍氏腸桿菌EB-247^T的序列同源性分別達到99.10%和99.38%；DP15與現有模式菌株居泉沙雷氏菌LMG 7882^T的序列同源性最高，達到98.75%；菌株DP28與現有模式菌株表皮葡萄球菌NCTC 11047^T（Staphylococcus epidermidis）的序列同源性達到99.38%。結合形態學特征和生理生化特性，確定DP12和DP15為霍氏腸桿菌；DP15為居泉沙雷氏菌；DP28為表皮葡萄球菌。

2.4達烏里胡枝子根際細菌生長曲線的測定

測定細菌的生長曲線，可更好地了解細菌的生長與繁殖規律，這對開發微生物菌劑及相關研究具有重要意義。各菌株生長曲線均可分為4個時期，即生長停滯期、指數生長期、平穩增長期和緩慢衰落期（圖3）。菌株DP12，DP25和DP29生長趨勢具有相同規律，其中菌株DP12，DP15，DP29在菌株接種后的前0～2 h處于生長停滯期，相較而言，生長速度較為緩慢。2～10 h內，菌株生長處于對數生長期，OD₆₀₀值開始迅速增加，活菌數量呈對數增加。10～28 h內，菌株生長速度逐漸減緩，逐漸到達峰值。24～30 h，菌株OD₆₀₀值趨于穩定，其中細菌的活菌數量不變階段為平穩生長期，細菌開始衰亡的階段為緩慢衰落期。而DP28生長趨勢與上述3株菌存在較大差異，在菌株接種后的前0～10 h處于生長停滯期，生長速度緩慢。10～18 h內，菌株生長處于對數生長期，OD₆₀₀值開始迅速增加，活菌數量呈對數增加。18～24 h內，菌株生長速度逐漸減緩，逐漸到達峰值。24～30 h增長速度處于停滯狀態，其中細菌的活菌數量不變階段為平穩生長期，細菌開始衰亡的階段為緩慢衰落期。

2.5達烏里胡枝子根際細菌耐鹽堿能力及耐高低溫能力測定

菌株DP12，DP15和DP29在4℃～37℃條件下均可生長，菌株DP28可在20℃～37℃條件下可生長。菌株DP12，DP15，DP28和DP29在0%～7%鹽濃度下均可生長（圖4），DP12和DP29在0%～5%鹽濃度水平長勢較好；DP15和DP28在0%～3%鹽濃度水平長勢較好，其中DP15在0%鹽濃度水平長勢最佳。菌株DP12，DP15，DP28和DP29在pH8～12的環境中下均可生長（圖4），相較而言，各時間段中，DP12，DP15和DP28在pH8環境中OD₆₀₀值均高于較其他堿性環境條件下。DP12，DP15和DP28在pH8～10水平長勢較好，DP29在pH8～11水平長勢較好。

2.6達烏里胡枝子根際細菌功能特性

2.6.1達烏里胡枝子根際細菌溶磷、固氮、解鉀能力菌株DP12，DP15和DP29解有機磷能力分別為0.80，0.64和0.64 mg·L^-1（表4）。通過解鉀菌篩選結果發現（圖5），接種菌株DP15，DP29的培養基上出現明顯透明圈，表明菌株具備解鉀能力。菌株DP12，DP15，DP29在NFM固體培養基上均生長良好，菌落形態明顯（表3，圖5），表明具有一定的固氮能力。

2.6.2達里胡枝子根際細菌產鐵載體、IAA、有機酸能力菌株DP12，DP15和DP29在CAS固體培養基上均形成透明圈，表明均具有分泌鐵載體能力。進一步定量測定菌株產鐵載體，菌株DP12，DP15，DP29菌株SU值分別為60.89%，47.77%和24.80%。

KMB液體培養基（L-色氨酸）上清液與等體積Salkowski比色液充分混合，顏色變為粉紅，表明4株菌株均具備分泌IAA能力。通過OD530定量測定發酵液中生長素含量，菌株DP12，DP15，DP28和DP29產IAA能力分別為60.89，44.65，35.09和24.80 mg·L^-1。

菌株DP12，DP15和DP29在溴甲酚紫為指示劑的固體培養基上均可形成明顯透明圈，表明菌株DP12，DP15和DP29均具備有機酸分泌能力。

2.7達烏里胡枝子根際細菌促生試驗

如表4和圖6所示，菌株DP12顯著提高達烏里胡枝子種子發芽率，較無菌水處理提高了9.5%（Plt;0.05）。接種菌株DP12，DP15，DP28和DP29達烏里胡枝子幼苗的鮮重較無菌水處理提高了32.16%，18.64%，24.77%和27.69%（Plt;0.05）；接種菌株DP12，DP15，DP28和DP29顯著促進達烏里胡枝子幼苗的株高及苗長的增加，較無菌水處理相比分別提高了28.43%和18.67%、42.84%和9.14%，32.95%和23.05，26.22%和42.46%（Plt;0.05）；除DP15外，其他菌株均能顯著增加達烏里胡枝子幼苗的主根長，達10.66%，15.09%和55.13%（Plt;0.05）。

如表4和圖6所示，菌株DP12和DP28對苜蓿幼苗的主根長度及苗長均顯著增加，分別較無菌水處理提高了31.55%和45.16%，19.24%和25.44%（Plt;0.05）。

4株根際細菌DP12，DP15，DP28和DP29均對燕麥幼苗具有顯著的促生作用（表4、圖6）。菌株DP12，DP15，DP28和DP29顯著促進燕麥幼苗的鮮重、株高、最長須根長度、苗長及側根數均增加，其中燕麥幼苗鮮重較無菌水對照組相較分別提高了24.59%，45.06%，44.98%和24.65%（Plt;0.05）；燕麥幼苗株高較無菌水對照組相較分別提高了152.41%，120.11%，140.02%和115.34%（Plt;0.05）；燕麥幼苗最長側根長度較無菌水對照組相較分別提高了88.67%，93.88%、65.78%和65.56%（Plt;0.05）；燕麥幼苗苗長較無菌水對照組相較分別提高了112.94%，103.87%，94.62%和84.53%（Plt;0.05）；燕麥幼苗側根數較無菌水對照組相較分別提高了64.04%，30.34%，49.06%和39.70%（Plt;0.05）。接種菌株DP15，DP28和DP29燕麥幼苗其他須根平均長度較無菌水對照組相較分別提高了118.30%，53.83%和52.99%（Plt;0.05）。

如表4和圖6所示，與無菌水對照組相較，接種菌株DP12，DP15，DP28和DP29后小黑麥幼苗的鮮重顯著增加，提高了21.53%，18.06%，16.37%和43.44%（Plt;0.05）。除菌株DP28外，接種菌株DP12，DP15和DP29小黑麥幼苗的最長側根較無菌水處理組顯著增長，提高了30.97%，36.65%和42.69%（Plt;0.05）。菌株DP15和DP29顯著促進小黑麥幼苗的苗長增加，較無菌水對照組提高了30.69%和32.36%（Plt;0.05）。菌株DP12和DP29小黑麥幼苗的其他側根長度及側根數較無菌水對照組顯著增加，提高了25.26%和54.41%，18.16%和18.39%（Plt;0.05）。

3討論

3.1達烏里胡枝子根際細菌耐鹽堿能力及耐高低溫能力的探討

根際促生菌的應用范圍易受菌株適應性能的影響［20］。因此，了解菌株耐受鹽堿及高低溫能力對后期生物改良制劑開發具有重要的參考價值。此外，我國牧草種植多集中于北方干旱和半干旱地區，具有降水量少、溫度低、土壤鹽堿化突出等特點，其中土壤鹽堿化可導致作物產量降低18%～40%［21］。而耐鹽有益細菌可通過提供礦物質（如氮、磷酸鹽和鉀）、激素（包括生長素、細胞分裂素和脫落酸）或減少乙烯的產生等，改善植物組織滲透平衡和離子毒害，緩解鹽脅迫，增加植物生物量［22-24］。當前對胡枝子屬植物耐鹽機制研究主要集中于抗氧化酶系統［25-26］，鮮有研究討論胡枝子屬植物耐鹽堿能力與其根際微生物潛在機理。本研究從鹽堿地達烏里胡枝子植物根際分離出4株具有促生功能的耐鹽堿菌株，結合形態學特征、生理生化特性及分子生物學鑒定，DP12和DP29初步鑒定為霍氏腸桿菌，在LB液體培養基中最適生長鹽濃度均為0%～5%，與前人研究結果一致［27］。Fahsi等［27］發現霍氏腸桿菌可耐受高溫達42℃，但未對其可耐受低溫范圍進行研究，而本研究發現霍氏腸桿菌可在4℃條件下生長。DP15和DP28初步鑒定為居泉沙雷氏菌和表皮葡萄球菌，在LB液體培養基中最適生長鹽濃度均為0%～3%，其中DP15能夠耐受4℃低溫。DP12，DP29，DP15和DP28具較強耐鹽性，這可能與其長期適應植物根際高鹽度有關。Behzad等［28］研究認為植物根際吸收的水分較多，導致其根際離子強度高，因此根際分離的微生物具有更好的高鹽度適應性。然而目前尚未有對居泉沙雷氏菌及表皮葡萄球菌耐受高低溫及最適生長的鹽堿范圍進行系統研究。此外，研究發現葡萄球菌屬、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬微生物廣泛存在于各類環境中，常作為促生菌定殖于植物根際與根內［29-31］。綜上所述，腸桿菌屬、表皮葡萄球菌屬具有較強的生物改良制劑開發潛力與價值，在提升牧草環境適應性、促進牧草生產和提高牧草品質等方面具有廣泛的應用潛力。

3.2達烏里胡枝子根際細菌生長特性

細菌在對數生長期和平穩增長期時代謝比較旺盛，對外界不良環境有較強的抵抗力［32］。本研究發現4株根際細菌具有對數生長期和穩定期較長的特點，對不良環境有較好的抗性。同時，菌株DP12，DP15，DP29生長停滯期短，可促使其迅速繁殖并定殖于植物根際，從而促進植物生長。此外，一般接種菌株選用對數期菌種，因此，菌株生長曲線作為實踐生產中重要參考依據［32］，而本研究發現不同屬菌株生長曲線趨勢具有較大差異，隨著菌株親緣關系接近，菌株生長趨勢趨于一致。因此，后續研究可將測定菌株的生長曲線作為鑒定菌種的參考依據。

3.3達烏里胡枝子根際細菌功能特性

植物發育與根構型取決于激素和營養水平［33］。研究表明，一定的IAA能夠刺激種子萌發，促進植物根系新陳代謝及根毛形成，增加植物對土壤中養分的吸收［34］。根際促生菌的固氮、解磷、解鉀能力可以增強土壤中營養物質的釋放［17，35-36］，而有機酸、鐵載體在調控土壤微生物磷代謝機制中均發揮重要作用［37-38］。此外，鐵載體具有螯合Al³⁺、Cu²⁺及Zn²⁺等金屬離子的能力，形成不能夠進入細胞內部的大分子物質，提高植物體對于重金屬脅迫的耐受能力［39］。微生物分泌的鐵載體在降低一些土傳病害及提高植物重金屬耐受能力等方面發揮重要作用。其原因是有益菌株通過分泌鐵載體同環境病原微生物進行鐵素競爭，從而降低病害的發生［39］。研究表明，根際細菌的多重促生特性在植物鹽脅迫、干旱等逆境脅迫中發揮著重要作用［40］。Fahsi等［26］從棗樹（Ziziphus）根際分離到的霍氏腸桿菌J146，其IAA分泌能力為550.44 mg·L^-1，可以解磷、固氮及產生鐵載體，促進小麥種子萌發和提高小麥株高及鮮重［25］。本研究篩選出的菌株DP12和DP29分離自同一地區的達烏里胡枝子根際，均屬于霍氏腸桿菌，分泌IAA能力分別可達60.89 mg·L^-1和24.80 mg·L^-1，遠低于霍氏腸桿菌J146，這可能是由于鑒定IAA分泌能力的培養基選擇不同。DP12和DP29兼具固氮、解鉀、有機酸分泌等能力，DP12亦可促進達烏里胡枝子種子萌發，DP29還具有解鉀功能。通過對菌株DP12和DP29的16S rRNA結果比較和分析，發現導致相同種菌株功能差異的原因可能是菌株間基因存在差異，與Guo等［41］研究一致。目前鮮有關于居泉沙雷氏菌IAA分泌能力的報道，僅有Jung等［30］在芝麻（Sesamum indicum）根際篩選出1株可分泌IAA的居泉沙雷氏菌GS2，但未測定其IAA分泌能力。菌株DP15分泌IAA能力達44.65 mg·L^-1，且兼具溶磷、固氮、解鉀、有機酸及鐵載體分泌的能力。Cheng等［42］從蘋果樹根際分離出1株表皮葡萄球菌YJ101，其IAA分泌能力為40.82～54.33 mg·L^-1，能夠顯著促進白三葉（Trifolium repense）地下部分生長，提高植株鮮重。DP28分泌IAA能力可達35.09 mg·L^-1，且兼具有機酸分泌能力。4株根際細菌對達烏里胡枝子、燕麥和小黑麥均表現出顯著的促生效果。此外，本試驗篩選的菌株DP12，DP15和DP29均有較好的鐵載體分泌能力，SU值分別為60.89%，47.77%和24.80%，但是否能夠應用于誘導植物抗病性、提升植物的耐受重金屬能力需進一步進行成株植物活體驗證。

3.4達烏里胡枝子根際細菌對4種牧草植物的促生作用

在促生試驗中，接種4株根際細菌的達烏里胡枝子生長狀況顯著優于對照，而接種DP15和DP29對苜蓿植株無顯著促生效果甚至出現抑制現象，這可能是由于達烏里胡枝子會主動在根際招募對其有益的微生物，進而促進其生長。植物根系分泌物是微生物群落演替的主要誘因，通過在根際中建立特定的生態位［43］，從周圍土壤向植物根際招募、富集有益微生物［44］。部分根際促生菌株促生作用不具有普遍適用性，因此針對廣譜性生物改良制劑及某一牧草專用生物改良制劑的篩選具有重要意義。本研究發現部分菌株對植株根系促生效果與菌株IAA分泌量無顯著正相關關系，表明IAA不是促進植物根系生長的唯一因素，根際細菌的多重促生特性可能是促進植物生長的潛在因素［45］。4株根際細菌均可提高若干種植株鮮重、根長及苗長，此外，本研究發現接種根際細菌后，植物干鮮重差異較大，這一現象是由于可能是由于根際細菌促進植物根系發育，從而提高根系對水分及養分利用能力［46］，而培養皿發芽試驗中無外源性養分，根際細菌更多是促進植物吸收利用水分，進而促進植株莖部生長及干鮮重變化。此外，本研究發現不同促生菌對植物的促生部位及促生效果存在較大差異，接種DP15的達烏里胡枝子株高生長狀況顯著優于其他處理組，而對達烏里胡枝子根部促進效果不及DP12，DP28和DP29接種處理明顯。因此，牧草生物改良制劑選擇中需結合生產實踐中實際需求，進而選擇合適生物改良制劑使用。此外，前人關于促生菌對禾本科促生研究的生理指標選擇為種子發芽率、植物干鮮重、株高、苗長等［1，47］，而未對禾本科植物須根數及全部須根平均長度進行統計。本研究發現接種部分根際促生菌可顯著促進禾本科植物其須根數及全部須根平均長度，表明位于植物根際或根表的具有多種植物生長促進性狀的細菌可以增加植物的生長和產量［38］，從而提升植物抗逆能力。

4結論

本研究從達烏里胡枝子根際篩選了菌株DP12，DP15，DP29和DP28中度耐鹽且促生功能多樣的根際細菌，隸屬為腸桿菌屬和葡萄球菌屬，其中，該4株菌株均可促進達烏里胡枝子和燕麥生長；菌株DP12，DP15和DP29可促進小黑麥生長；菌株DP12和DP28可促進苜蓿顯著生長。因此，該4株菌株可作為達烏里胡枝子、苜蓿、燕麥和小黑麥專用生物改良制劑的潛在菌種資源，為應對生產實踐中的復雜環境和測試其穩定性的田間試驗提供了一定依據。

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（責任編輯 彭露茜）