窄竹葉柴胡內參基因篩選及皂苷合成關鍵酶基因表達分析

摘要：窄竹葉柴胡（Bupleurum marginatum var. stenophyllum）為柴胡屬多年生高大型草本植物，以根入藥稱為藏柴胡，具有較高的藥用價值。本試驗采用實時熒光定量PCR技術，利用geNorm、NormFinder及BestKeeper3種不同數據分析軟件，從5個常用的候選基因（Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α）篩選出可在窄竹葉柴胡不同器官穩定表達的基因作為內參基因，并利用篩選得到的內參基因分析皂苷合成關鍵酶基因（HMGR，IPPI，FPS，SS，β-AS）在窄竹葉柴胡不同器官的相對表達量。結果表明β-tubulin基因可作為窄竹葉柴胡不同器官穩定表達的內參基因；皂苷合成關鍵酶基因在窄竹葉柴胡的不同器官中表達量有顯著差異，IPPI基因在種子中表達量最高，其他基因在根中的表達量均高于在其他器官中的表達量，其中HMGR，FPS，SS在側根的表達量高于主根。因此，窄竹葉柴胡各器官皂苷合成關鍵酶基因的表達量不同，最適內參基因為β-tubulin基因，本研究為窄竹葉柴胡分子生物學研究提供一定依據，促進其合理開發和利用。

關鍵詞：窄竹葉柴胡；內參基因；柴胡皂苷；實時熒光定量PCR；表達分析

中圖分類號：S153文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）04-1001-07

Screening of Internal Reference Genes of Bupleurum marginatum var.

stenophyllum and Analysis of Gene Expression of Saikosaponin Key Enzymes

SUN Zhe DU Xiao-rong HUA Long LI Ao-xuan SONG Yun HAN Ming-zhe QIAO Yong-gang

（1.College of Life Sciences， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China; 2.Shanxi key lab. for modernization"of TCVM， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：Bupleurum marginatum Wall. ex DC. var. stenophyllum （Wolff） Shan et Y. Li is a perennial shrubby herb of the genus Bupleurum，with high medicinal value as the root is known as Tibetan Bupleurum. In this experiment，real-time quantitative PCR technology was used，combined with the three different data analysis softwares of the geNorm，NormFinder and BestKeeper to screen out the genes that can be stably expressed in different organs of B. marginatum var. stenophyllum from the five commonly used candidate genes：Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin and EF-1α as the internal reference genes，and then the selected internal reference genes were used to analyze the key enzyme genes of saikosaponin by the relative expression levels of HMGR，IPPI，FPS，SS，β-AS in different organs of B. marginatum var. stenophyllum. The results showed that β-tubulin gene could be used as an internal reference gene for its stable expression in different organs of B. marginatum var. stenophyllum;different saikosaponin synthase genes were expressed differently in different organs of B. marginatum var. stenophyllum. Except for IPPI gene which had the highest expression in seeds. The expression levels of HMGR，FPS，SS and β-AS in roots were higher than those in other organs，and the expression levels of HMGR，FPS and SS in lateral roots were higher than those in main roots. Therefore，the expression levels of key enzyme genes for saponin synthesis in different parts of B. marginatum var. stenophyllum were different. The optimal internal reference gene is β-tubulin gene，which can provide a basis for molecular biology research of B. marginatum var. stenophyllum and this research could promote its rational development and wide utilization.

Key words：Bupleurum marginatum var. stenophyllum;Internal reference gene;Saikosaponin;Real-time quantitative PCR;Expression analysis

中藥材柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根，按照產地和性狀等不同將其分為北柴胡和南柴胡［1］。柴胡作為國內常見的傳統中藥材，對于治療感冒發燒發熱、寒熱虛實往來、月經不調等疾病具有顯著的療效，有解表退燒、升舉陽氣、疏肝解郁的功能［2］，同時柴胡的多糖結構具有較好的抗疲勞功效［3］。柴胡在中藥材市場上出現了供不應求的狀況，近幾年來甘肅渭源等地的藥材種植戶引進了一種名為“藏柴胡”［4］的高產柴胡，經鑒定為傘形科柴胡屬植物窄竹葉柴胡（Bupleurum marginatum Wall. ex DC. var. stenophyllum （Wolff） Shan et Y. Li），主要藥效成分為柴胡皂苷（saikosaponin，SS），具有抗菌消炎、抗病毒等功效［5］，含量大約為北柴胡的3～4倍，按其分子結構的不同可分為a、b、c和d等類型，其中柴胡皂苷d的藥理活性最好，動物實驗結果表明，藏柴胡的毒性大于北柴胡［6］，具有很高的研究價值。基于目前市場需求與柴胡研究進展，下一步的研究熱點集中在植物化學研究與生物學發育機制分析，為柴胡資源綜合開發利用提供更好的指導［7］。窄竹葉柴胡相關基礎研究報道較少，開展窄竹葉柴胡生物學研究，對合理開發利用窄竹葉柴胡資源十分必要。

實時熒光定量PCR技術［8］具有高效、靈敏、安全等優勢，其結果以擴增曲線的形式呈現，更加直觀［9-10］。在基因表達分析中，樣品間RNA濃度及質量差異會對實驗結果造成影響，內參基因可以校準因樣品差異造成的誤差，提高研究結果準確性［11］。在研究基因表達時需要篩選在植物不同生長階段及不同器官穩定表達的內參基因，傘形科植物常用β微管蛋白（β-tubulin）、親環蛋白（Cyclophilin）、肌動蛋白（Actin）、轉錄延伸因子（EF-1α）和α微管蛋白（α-tubulin）等作為內參基因［12-14］。geNorm、NormFinder以及BestKeeper等軟件是常用的分析候選內參基因軟件［15-16］。柴胡皂苷合成的上游關鍵酶基因［17］：異戊烯基焦磷酸異構酶（IPPI）、法尼基焦磷酸合成酶（FPS）、3-羥基-甲基戊二酰CoA還原酶（HMGR）、β-香樹素合成酶（β-AS）和鯊烯合成酶（SS）等基因對柴胡皂苷的合成具有重要作用，確定不同基因在柴胡不同器官的表達模式對從分子水平了解柴胡皂苷的合成具有重要意義。

本研究以窄竹葉柴胡為試驗材料，利用實時熒光定量PCR技術，對5個候選基因（β-tubulin，Cyclophilin，Actin，EF-1α，α-tubulin）進行表達量分析，并使用geNorm、NormFinder以及BestKeeper篩選在窄竹葉柴胡莖、葉、花、種子以及根上部、根中部、側根和須根中均可穩定表達的最適基因。應用篩選所得到的內參基因，對其上游合成關鍵酶基因（HMGR，IPPI，FPS，SS，β-AS）在不同器官的表達量進行分析，為柴胡皂苷合成關鍵酶基因的深入研究奠定基礎，為推動窄竹葉柴胡在未來分子生物學領域的研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

窄竹葉柴胡種子來自甘肅省臨洮縣，2020年4月種植于山西省晉中市太谷區申奉試驗田，2021年7月取窄竹葉柴胡的根、莖、葉、花、種子，用酒精棉擦拭后迅速放于液氮，于—80℃冰箱保存備用。所選取的窄竹葉柴胡的根上部（蘆頭）、根中部（根全長的1/2處，取1～2 cm）、側根（主根產生的分支）和須根（側根產生的毛狀分支）、莖、葉、花、種子部位如圖1所示。

1.2試驗方法

1.2.1RNA的提取及cDNA的合成分別取窄竹葉柴胡的莖、葉、花、種子、根上部、根中部、側根和須根各0.2 g，使用華越洋RNA提取試劑盒（0416-50 GK型）提取各器官樣品的RNA。用Nanodrop 2000C檢測不同樣品RNA的濃度和純度并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。將所提取的RNA稀釋至同一濃度（100 ng·μL^-1）。采用全式金反轉錄試劑盒法（AE311-03）將RNA逆轉錄合成cDNA，-20℃保存備用。

1.2.2內參基因及目的基因的引物設計窄竹葉柴胡中可以穩定表達的內參基因還未見報道。本試驗選取一些當前傘形科柴胡屬植物已經報道的5個常用的內參基因作為候選基因［14］，篩選出5個參與柴胡皂苷合成的上游基因，根據NCBI所發表的序列利用primer5.0設計引物。候選基因與柴胡皂苷合成關鍵酶基因引物序列信息見表1。

1.2.3候選基因及目的基因特異性檢測以根上部的cDNA為模板分別對候選基因（Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α）以及參與柴胡皂苷合成的關鍵酶基因（HMGR，IPPI，FPS，SS，β-AS）進行PCR擴增。用1%瓊脂糖凝膠電泳對候選基因及目的基因的擴增產物進行特異性分析。PCR反應體系及擴增程序見表2。

1.2.4內參基因實時熒光定量PCR檢測及穩定性評價以窄竹葉柴胡的莖、葉、花、種子以及根上部、根中部、側根和須根的cDNA為模板分別對各個候選基因（Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α）的表達水平進行研究。采用Bio-Rad CFX-96熒光定量PCR儀進行本試驗，反應體系為10 μL：Premix E×Taq 5.0 μL，上游和下游引物分別為0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.0 μL。RT-qPCR反應步驟：預變性94℃，180 s；變性94℃，10 s；退火60℃，30 s；延伸72℃，20 s，45個循環，70～95℃熔解曲線：0.5℃，5 s，信號采集。

將5個候選基因的Ct值使用EXCEL2016整理后輸入到geNorm、NormFinder和BestKeeper數據分析軟件統計分析表達的穩定性。計算每個候選基因根據3款不同數據分析軟件分析所得的表達穩定性排名的幾何平均數得到最終的排名指數，該指數越小，說明內參基因表達量越高穩定性越好；反之，則表達穩定性越低［18］。

1.2.5柴胡皂苷合成關鍵酶基因相對表達量測定以窄竹葉柴胡的莖、葉、花、種子以及根上部、根中部、側根和須根的cDNA為模板，以篩選到的內參基因β-tubulin為參照，對窄竹葉柴胡中柴胡皂苷合成的各主要酶基因（HMGR，IPPI，FPS，SS，β-AS）進行實時熒光定量PCR擴增，引物信息見表1，試驗設置3次重復。反應體系及擴增程序與“1.2.4”相同，采用2-ΔΔCt法分析計算皂苷合成關鍵酶基因的相對表達量。

2結果與分析

2.1窄竹葉柴胡RNA提取結果

利用Nanodrop 2000C測定了待測樣品RNA的濃度和純度，結果顯示，所提取的RNA濃度均大于100 ng·μL-1，A260/280均在1.9到2.1范圍內，且A260/230值在2.0到2.3之間，均在可用范圍之內。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對獲取的RNA進行質量檢測，電泳結果顯示條帶清晰，無拖尾現象（圖2）。因此，RNA的完整性良好，可以進行cDNA合成及用于后續試驗。

2.2候選基因與目的基因引物特異性檢驗

通過PCR分別對窄竹葉柴胡的候選基因及參與柴胡皂苷合成的關鍵酶基因進行擴增。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，各個基因的擴增條帶單一，且無重疊現象，沒有雜帶和引物二聚體的出現（圖3）。則說明合成的目的基因及候選基因的引物具有較高的特異性，可以進行后續試驗。

2.3候選基因RT-qPCR表達分析

經過實時熒光定量PCR分析測定5個候選基因（Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α）在窄竹葉柴胡不同器官的表達Ct值，結果如圖4所示。Ct值反映了各個候選基因的表達穩定性，5個候選基因的Ct值在20～36之間，α-tubulin的Ct值為31.43～35.11，表達量最低，Actin，EF-1α基因Ct值較低，波動較大。

僅依靠Ct值的大小無法篩選出最適內參基因，通過geNorm、NormFinder及BestKeeper數據分析軟件，對各個候選基因的穩定性進行評價，綜合排名取其幾何平均值，結果如表3所示，β-tubulin的綜合排名最靠前，結合Ct值數據，發現表達量較高，表達穩定性較好，可以將其選為內參基因。

2.4柴胡皂苷合成關鍵酶基因相對表達量分析

以β-tubulin基因作為參照，對參與柴胡皂苷合成關鍵酶基因HMGR，IPPI，FPS，SS，β-AS分別在窄竹葉柴胡的莖、葉、花、種子以及根上部、根中部、側根和須根中的表達量進行分析與測定，并利用2^-ΔΔCt方法計算其相對表達量如圖5所示。HMGR基因在窄竹葉柴胡的側根和須根中表達量最高，其次是根中部和根上部，在莖、葉、花和種子中表達量較低；IPPI基因在窄竹葉柴胡種子中的相對表達量明顯高于其他器官；SS基因在窄竹葉柴胡不同器官中的相對表達量由高到低分別為：側根gt;須根gt;根中部gt;種子gt;根上部gt;葉gt;莖gt;花；除IPPI基因外其余基因在根中的表達量均明顯高于其他器官。由上述分析可知，在窄竹葉柴胡中，主要參與柴胡皂苷合成的酶基因在不同的器官具有穩定的表達，它們都能參與柴胡皂苷的合成和積累，大部分基因在根中的表達量高于其他器官。

3討論

3.1內參基因篩選

內參基因對目的基因的表達至關重要，不同物種的不同器官、不同取樣時間以及經過不同的處理之后，基因的表達會發生變化，因此需要篩選在不同條件下最適宜的內參基因作為參照，以此來保證目的基因的穩定表達［19］。劉艷霞等［20］篩選出在NaCl和PEG脅迫下藜和灰綠藜中均共同穩定表達的內參基因GAPDH，β-ACTIN、β-TUBULIN分別在藜和灰綠藜中穩定表達；蔣婷婷等［21］篩選了石蒜屬植物換錦花、石蒜和中國石蒜內參基因，發現同種植物在不同器官和不同發育時期穩定表達的內參基因表達差異明顯，需要分別篩選；張麗麗等［22-23］也從事過相關研究。柴胡是我國常用的大宗藥材之一，主要藥用成分為柴胡皂苷，而窄竹葉柴胡的柴胡皂苷含量更高［24］，有望成為柴胡與狹葉柴胡的替代品［25］，目前對窄竹葉柴胡（藏柴胡）的研究多集中在摻偽鑒定［26-29］與化學成分的研究［30-31］，尚未有最適內參基因的相關報道。因此開展窄竹葉柴胡最適內參基因的篩選，研究窄竹葉柴胡不同器官的柴胡皂苷合成關鍵酶基因的表達量，對窄竹葉柴胡的基因功能研究至關重要。本試驗在5個植物常用的內參基因（Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α）中篩選出β-tubulin為最適內參基因，該基因在窄竹葉柴胡的不同器官中均可以穩定表達，與在同屬植物北柴胡、狹葉柴胡不同器官所篩選出的最適內參基因一致［12，32］。

3.2皂苷合成關鍵酶基因表達與皂苷含量

柴胡不同器官中柴胡皂苷含量不同，北柴胡根中皂苷含量最高，果和葉次之，莖中含量最少［14］；地下部分皂苷含量明顯高于地上部分，根部不同位置的皂苷含量也有明顯差異，從蘆頭到根尖含量逐漸增高，地上部分則越往上含量越低［33］；側根的皂苷含量明顯高于主根［34-35］。皂苷合成關鍵酶基因的表達量與不同器官的皂苷含量密切相關，趙鈺等［14］研究柴胡皂苷含量與其關鍵酶基因表達量的相關性結果表明，HMGR，β-AS，P450-7，P450-12這4個基因的表達量與柴胡皂苷和含量均有一定的相關性，對于皂苷合成積累有重要影響，宋鑫等研究刺五加P450基因的表達對皂苷含量的影響，結果表明，7條EsP450基因的表達與皂苷含量呈正相關關系［36］。本研究選用5個皂苷合成關鍵酶上游基因（HMGR，IPPI，FPS，SS，β-AS）作為目的基因，測定其在窄竹葉柴胡不同器官的表達量。結果顯示HMGR，FPS，SS基因在根部的表達量均高于其他器官，且側根（側根和須根）的表達量高于主根（根上部和根中部），與預期結果一致。IPPI基因在種子中的表達量最高，β-AS在根上部的表達量最高，可能只是參與柴胡皂苷的合成的中間途徑，并不決定柴胡皂苷的含量。柴胡皂苷的生物合成機制復雜，相關基因的表達模式可能會受環境或者其他因素的控制，其分子機制需要更加深入的研究。通過對窄竹葉柴胡內參基因及柴胡皂苷合成關鍵酶基因的研究可以為其分子機制的研究提供參考，并為其藥材質量的調控提供一定的依據。

4結論

本試驗選取5個常用的候選基因Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α，并從中篩選出可在窄竹葉柴胡不同器官穩定表達的內參基因為β-tubulin。分析皂苷合成關鍵酶基因（HMGR，IPPI，FPS，SS，β-AS）在窄竹葉柴胡不同器官的相對表達量，發現IPPI基因在種子中表達量最高，其他基因在根中的表達量較高，其中HMGR，FPS，SS在側根的表達量高于主根，因此，窄竹葉柴胡不同器官皂苷合成關鍵酶基因的表達量不同。本研究豐富了窄竹葉柴胡的分子生物學研究，為其分子機制的研究提供參考，促進其合理開發和利用。

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（責任編輯 彭露茜）