Pink1/Parkin 介導的線粒體自噬在急性肺損傷中的作用研究進展

陳 興,李紅衛,趙永健,馮世海

(南開大學附屬醫院 天津市第四醫院燒傷科,天津 300222)

膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應綜合征，它是嚴重創(燒)傷、休克、感染及外科大手術患者常見的并發癥，進一步發展可導致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(MODS)，是臨床危重患者最主要死亡原因之一[1]。在膿毒癥導致的MODS中，以膿毒癥急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)發病率和死亡率最高，是現代創(燒)傷外科及危重病醫學面臨的突出難題[2]。研究表明機體過度炎癥反應導致的肺泡Ⅱ型上皮細胞(AT-Ⅱ)功能紊亂與膿毒性休克和 MODS 的發生發展密切相關[3]。近年來研究發現線粒體凋亡通路是引發AT-Ⅱ凋亡的重要途徑，在AT-Ⅱ凋亡中起關鍵作用，不同凋亡途徑都通過作用于線粒體來決定凋亡是否發生[4]。線粒體是雙膜結構的細胞器，主要通過氧化磷酸化合成 ATP，為細胞的持續運行提供能量，與此同時,也可生成活性氧簇(ROS)[5]。ROS可引起線粒體的損傷,釋放促凋亡因子,以及開放線粒體通透性轉換孔等導致細胞的死亡[6]。因此，在急性肺損傷過程中清除肺泡Ⅱ型上皮細胞中的受損線粒體具有重要意義。

Christian de Duve 在1980年提出“自噬(autophagy)”的概念，是細胞蛋白質和細胞器通過自身溶酶體將其降解的一個過程[7]。具體過程為由內質網及高爾基體形成的雙層脂質膜，將細胞內的物質(如蛋白質聚集體，多種細胞器)進行擴展、吞噬，并包裹在自噬體之中，該自噬體往往是雙層膜結構；之后，通過與溶酶體相互融合繼而成熟，自噬體中包裹的內容物再利用溶酶體酶降解，最后降解產物被轉運至細胞質，進行回收利用[8]。可見，自噬可將受損細胞進行回收，可通過清除非功能性蛋白質和細胞器來維持細胞穩定[9]。線粒體自噬這一概念首次由Lemasters等提出[10]，線粒體嚴重損傷或融合受損后，線粒體內碎片會逐漸增多，這些碎片、受損和衰老的線粒體隨后被細胞選擇性地清除，從而達到維持細胞內環境穩定的過程。在肺泡Ⅱ型上皮細胞中，線粒體自噬通過調節線粒體的質量與數量維持其正常運行，但當受到氧化應激、缺血、缺氧等刺激時，過度的線粒體自噬或線粒體自噬不足均可影響肺泡Ⅱ型上皮細胞的功能，甚至導致肺泡Ⅱ型上皮細胞死亡，因此嚴格控制肺泡Ⅱ型上皮細胞中線粒體自噬的激活程度將十分必要[11]。線粒體自噬僅存在于哺乳動物細胞中，是其特有的選擇性自噬方式。目前對線粒體自噬調控通路的研究中，發現主要有NIX/BNIP3和FUDNC1以及PINK1/Parkin三條信號通路[12-13]。其中，目前研究最廣泛的線粒體自噬途徑為Pink1/Parkin介導的線粒體自噬，本文就其在急性肺損傷中的作用予以綜述。

1 Pink1、Parkin 的結構及其介導的線粒體自噬

1.1Pink1、Parkin的結構：Pink1蛋白作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶發揮作用，含有581種氨基酸殘基，由N端線粒體靶向序列、跨膜結構域和激酶結構組成[14]。其N端為靶定信號，連接疏水跨膜區，為線粒體內膜轉移終止信號，156～509之間的殘基構成絲氨酸/蘇氨酸跨膜結構域，連接C端結構域，作為線粒體外膜滯留信號[15]。其N端線粒體靶向序列在線粒體外膜轉位酶和線粒體內膜轉位酶的作用下將Pink1導入線粒體內[16]，經早老素相關菱形蛋白降解，使Pink1維持在較低表達水平[17]。通常在生理情況下，細胞內Pink1含量極低，而在細胞受到相關刺激，導致線粒體膜電位受損時，PINK1進入線粒體內膜的路徑被阻斷；此時，PINK1將逐漸聚集于受損的線粒體外膜，并將Parkin募集至受損線粒體[18]。

Parkin是一種E3泛素連接酶，多數位于細胞質、少數位于線粒體，由465種氨基酸組成，其N端是一個泛素樣結構域和4個富含半胱氨酸并能與鋅結合的RING結構域[19]。其中，泛素樣結構域可以被Pink1 磷酸化激活[20]。Parkin 主要位于胞質中，既具有連接酶的活性，使底物被蛋白酶識別并降解，又可以通過單泛素化底物或由泛素內賴氨酸形成泛素化長鏈，從而調控信號通路[21]。

1.2Pink1/Parkin介導的線粒體自噬：經典的線粒體自噬途徑為Pink1/Parkin介導的線粒體自噬，它也是目前受到關注最多的線粒體自噬途徑，得到的研究也最廣泛。細胞在受到多種刺激條件刺激下(如：營養缺乏、細胞衰老、炎性反應、缺血、缺氧等)，細胞內線粒體的代謝方式由有氧代謝轉化為無氧代謝，線粒體外膜被誘導產生去極化，致使線粒體內外膜轉位酶和水解酶功能均發生障礙，阻斷Pink1的轉位與降解，使得Pink1聚集在線粒體上[22]; 然后，位于Parkin的絲氨酸65殘基和泛素被Pink1磷酸化，從而激活Parkin[23]; 同時，Pink1 在蘇氨酸11和絲氨酸42處對線粒體外膜融合蛋白2磷酸化，從而招募Parkin聚集[14]; 最后，聚集在線粒體外膜的Parkin 將外膜蛋白泛素化，進而與微管相關蛋白相結合，并逐漸將受損或碎片化的線粒體包裹進自噬體中，進一步與溶酶體相融合，從而降解與清除這些受損線粒體[24]。Pink1和 Parkin的缺失會使細胞對受損線粒體的降解能力降低，使得受損細胞器累積，最終導致細胞死亡[25]。因此，Pink1/Parkin 介導的線粒體自噬對于維持細胞內環境的穩定和細胞生存具有重要意義。

2 Pink1/Parkin 介導的線粒體自噬的調控

2.1Pink1的磷酸化與Parkin的泛素化調控：線粒體外膜去極化后，聚集在其表面的Pink1可以通過磷酸化泛素來激活和招募Parkin，而含EF-hand結構域2的蛋白磷酸酶可拮抗Pink1的磷酸酶，抑制Pink1依賴的線粒體自噬[26]。蛋白磷酸酶PTEN-L也可抑制泛素磷酸化，阻斷磷酸化泛素鏈的形成;此外，PTEN-L還可防止Parkin向線粒體的移位，抑制Parkin的E3泛素連接酶活性，并阻止其誘導的線粒體自噬[27]。由此可見，Pink1的磷酸化在Pink1/Parkin介導的線粒體自噬中具有重要的調控作用。在Parkin泛素化在Pink1/Parkin介導的線粒體自噬的調節作用中，泛素特異性蛋白酶30起到對抗Parkin介導的泛素化的作用，從而抑制線粒體自噬的發生[28]。而泛素特異性蛋白酶33可以從Parkin中去除泛素耦聯物，在Lys435處使Parkin去泛素化，抑制Parkin蛋白轉移至去極化的線粒體上，從而抑制線粒體自噬的發生[29]。因此，Pink1的磷酸化功能與Parkin泛素化功能的調控可以影響其介導的線粒體自噬的激活，達到控制線粒體質量和數量平衡的目的。

2.2氧化應激對 Pink1/Parkin 介導的線粒體自噬的調控：活性氧類(ROS)是線粒體在呼吸作用中產生惡副產物。ROS可以啟動一系列氧化損傷反應，破壞線粒體膜蛋白，使線粒體 DNA 發生突變，翻譯異常，進而使得異常蛋白質增加，并發生錯誤折疊與聚集；同時，ROS還可致使線粒體通透性發生轉變，引起線粒體腫脹、功能失調等一系列改變，最終導致細胞凋亡增加[30]。Eliza Tsitoura對比了原發性肺纖維化(IPF)患者與健康個體肺泡灌洗液中線粒體活性氧(mtROS)、線粒體形態、相關基因表達和線粒體自噬相關因子PINK1、PARK2和NRF1水平。結果提示IPF患者肺泡巨噬細胞中的線粒體存在明顯的形態學缺陷和轉錄受損，與線粒體穩態調節因子PINK1、PARK2和NRF1的顯著減少平行。同時，mtROS在IPF中顯著升高，提示在IPF患者中ROS可激活線粒體自噬的過程[31]。

研究顯示，ROS 是線粒體自噬的必要條件[32]。羰基氰化物間氯苯腙可促進ROS的產生，誘導線粒體去極化，將過氧化物酶6招募到去極化的線粒體上，促進Parkin從細胞質通過線粒體外膜轉移到線粒體中，最后通過自噬途徑將受損線粒體清除[33]。另有研究顯示，鄰苯二甲酸二-2-乙基己基酯和1，4-苯醌均可通過增加 ROS 的產生，降低線粒體膜電位，增強線粒體碎片化，加劇了線粒體損傷，同時，增加磷酸化泛素(pSer 65 Ub)水平，并導致Parkin在線粒體激活、易位，進而激活線粒體自噬通路[34]。

氧化應激及其主要產物ROS是 Pink1/Parkin 介導的線粒體自噬發生的重要調控因素，因此可以通過調節氧化應激水平來對 Pink1/Parkin 介導的線粒體自噬進行調控。

2.3血紅素加氧酶-1(HO-1)對 Pink1/Parkin 介導的線粒體自噬的調控：HO-1可調節血紅素分解代謝過程，是其限速酶之一，細胞通過在線粒體募集HO-1，可啟動線粒體自噬過程，參與線粒體的調節[35]。通過給予不同濃度LPS以建立膿毒癥ALI模型，發現隨著LPS濃度升高，肺上皮細胞中胞p-RIP3、RIPK1、p-MLKL、TNF-α、PINK1、Drp1、LC3B蛋白相對表達水平均升高,線粒體膜電位降低，提示LPS可導致肺上皮細胞壞死性凋亡，并激活線粒體自噬。同時，HO-1誘導并激活線粒體自噬的動態過程，使得Mfn2、OPA1、Drp1增加，并在mRNA和蛋白質水平促進了線粒體自噬的關鍵介質(Parkin、PINK1)的生成[36]。

3 Pink1/Parkin 介導的線粒體自噬在急性肺損傷中的作用

在體內實驗和體外實驗中，應用脂多糖(LPS)均可誘導產生急性肺損傷ALI，而線粒體自噬在ALI的不同階段可以發揮著不同的作用。在早期階段，細胞死亡主要由自噬引起，這種情況在傷后2 h達到峰值;隨著ALI進展,肺組織細胞中自噬逐漸下調而調亡逐漸上調[37]。骨髓間充質干細胞(MSC)通過PINK1/parkin信號通路增強自噬，導致線粒體裂變蛋白DRP1和其他DAMP途徑介質(如S100A4和S100A8、HMGB1、RAGE和AGE)顯著增加，受損的線粒體及線粒體碎片得到清除，同時mfn1、mfn2和opa1等融合基因的表達得到增加，最終減少了ALI時肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷，起到保護肺泡上皮細胞的作用[38]。線粒體自噬在氯氣誘發的ALI反應過程中發揮了保護性作用,將NCI-H441(人肺腺癌上皮)細胞暴露于氯氣中，作用1 h后，細胞生物能功能和線粒體膜電位下降。用線粒體氧化還原調節劑MitoQ治療可減輕這些生物能缺陷；暴露后6 h，自噬顯著增加。NCI-H441細胞用自噬激活劑海藻糖預處理后，再暴露于氯氣作用，其細胞的功能得到改善，而使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤進行預處理，可導致細胞功能障礙增加，表明線粒體自噬在體外可發揮保護作用[39]。

而在機械通氣中，線粒體自噬對肺部功能的作用則截然相反。大潮氣量通氣可以快速激活肺泡Ⅱ型上皮細胞自噬，選擇性沉默肺泡Ⅱ型上皮細胞Atg5基因,可以增加機械通氣誘發的NLRP3炎癥小體活化及肺損傷。由此可見，抑制肺泡Ⅱ型上皮細胞線粒體自噬活化,會加重機械通氣相關ALI[40]。與此相反，在高氧誘導的急性肺損傷中，大鼠的肺miR-21-5p水平顯著降低，miR-21-5p通過與靶基因PGAM5直接結合，抑制線粒體自噬和線粒體功能障礙，反而可以改善高氧誘導的急性肺損傷。而過度激活的線粒體自噬，則加重肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷[41]。

4 小結

ALI是臨床常見的急危重癥，機體通過產生ROS 和減少ATP 釋放引起線粒體功能障礙，加重病情進展。作為一種保護性誘導過程，在肺泡Ⅱ型上皮細胞中適度激活線粒體自噬，可通過抑制炎性反應，有效保護肺功能，為ALI的治療提供新的思路。但目前關于Pink1/Parkin介導的線粒體自噬的研究主要集中在針對肺巨噬細胞，對肺泡Ⅱ型上皮細胞的研究較少，且Pink1/Parkin介導的線粒體自噬在急性肺損傷中的作用存在也不同的觀點。線粒體自噬是一個動態過程，在單一靜態時間點評估Pink1/Parkin的表達可能會產生誤導性結果，調控其適度激活具有一定難度，且因此未來需對線粒體自噬進行全面評估，以把控急性肺損傷中肺泡Ⅱ型上皮細胞線粒體自噬的激活程度，從而對急性肺損傷的治療提供指導。