絲素蛋白復合脫鈣骨基質對幼兔橈骨骨缺損的修復作用

陳 利,侯秀云,張國波,孫燕俠,張 薇,劉建民,蔡志雄,吳偉東,王 健

[遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院小兒外科，廣東 珠海 519100]

在小兒骨科領域，有許多復雜的先天性肢體畸形，矯治過程中由于大段骨缺損需要各種修復材料進行結構和功能的重建。骨髓炎清創、嚴重創傷、巨大骨腫瘤切除術等，均易導致兒童肢體大段骨缺損，進而導致肢體遺留殘疾。嚴重影響其生長發育和身心健康，給患兒家庭以及社會帶來沉重的經濟和精神負擔[1]。用何種材料修復較大范圍的骨缺損一直是臨床醫生思考的問題。目前對缺損的修復多采用自體骨移植，效果滿意。但自體骨移植必須從健康部位切取骨組織修復病損部位，增加創傷，對供區造成新的骨缺損，且由于兒童體型較小，軟骨較多，還需考慮兒童發育等因素，自體骨組織供區十分有限[2]。因此，對于較大面積的骨缺損，尋找一種安全、可靠的人工材料來替代自體骨移植就顯得尤為重要。本研究通過制作不同比例絲素蛋白復合脫鈣骨基質作為骨修復材料對幼兔骨缺損模型進行修復，通過生物力學實驗和結構形態觀察，探討該復合材料的力學性能和結構特征。

1 材料和方法

1.1主要實驗材料

1.1.1實驗動物：3月齡健康、清潔級新西蘭幼兔54只，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg，由遵義醫科大學(珠海校區)動物實驗中心提供。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.1.2主要儀器：①深低溫冰箱，日本三洋公司；②粉碎機，青島NDD公司；③手術器械，上海醫療器械公司；④恒溫培養箱，日本三洋公司；⑤超純水裝置，天津龍川公司；⑥線鋸，德國；⑦高壓滅菌鍋，上海申安；⑧離心機，德國西格瑪；⑨X攝片機，美國GE公司；⑩AE電子天平，瑞士mettler toledo公司；石蠟包埋機，德國萊卡公司；石蠟切片機，德國萊卡公司；顯微鏡BX50，奧林巴斯；數碼成像系統DP50，奧林巴斯。

1.1.3主要試劑：①戊巴比妥鈉，美國Sigma；②碳酸鈉試劑，北京化學試劑廠；③氯化鈣試劑，北京化學試劑廠；④鹽酸(37%)，北京益利精細化學品試公司；⑤無水乙醚，北京益利精細化學品試公司；⑥六氟異丙醇，濟南凱化化工公司；⑦蘇木素，北京化學試劑廠；⑧伊紅，北京化學試劑廠；⑨改良Masson三色染色試劑盒，北京Leagene公司；⑩Anti-Osteocalci抗體(鼠)，Abcam公司；Anti-CollagenⅠ抗體(兔)，Abcam公司；免疫組化檢測試劑盒SP-9001 (兔)，中杉金橋；免疫組化檢測試劑盒SP-9002 (鼠)，中杉金橋；DAB顯色試劑盒ZLI-9018，中杉金橋；EDTA液，北京化學試劑公司；PBS緩沖液，美國Amresco公司；乙酸，北京益利精細化學品試公司；甲酸，北京益利精細化學品試公司。

1.2試驗方法

1.2.1絲素蛋白DBM復合物的制備：將家養蠶絲置于97℃ Na2CO3(0.1%溶液)中，設定28 min 3次，37℃晾干后，用CaCl2-CH2CH2OHH2O溶液將其溶解(摩爾比為1∶2∶8)，用雙蒸水透析并將其凍干。DBM制備：選取3月齡健康新西蘭幼兔12只，耳緣靜脈推注空氣處死,取雙側尺橈骨骨干皮質骨塊，經-80℃深低溫冷凍,利用粉碎機粉碎形成顆粒狀，反復粉碎并篩選小于200 μm的顆粒物;經C4H10O(脫脂)、HCl(脫鈣)處理后凍干,最后利用輻照滅菌備用。

1.2.2絲素蛋白復合DBM骨修復材料的制備:將凍干的絲素蛋白加入六氟異丙醇與絲素蛋白混合溶解;再加入已篩選好的DBM顆粒(200 μm)，將SF和DBM以DBM占復合物總體積的一定比例(0%、10%、20%、40%、80%)混合;將混合物置入模具中固化，得到不同比例的SF與DBM復合材料備用。

1.2.3橈骨缺損模型的建立及復合材料修復:選取3月齡健康、清潔級雄性新西蘭幼兔42只，體重2.0～2.5 kg，由遵義醫科大學動物實驗中心提供。應用隨機抽簽法將其分為7組分別放入A、B、C、D、E、F、G籠，每組6只。均在右側前臂行橈骨缺損手術建立骨缺損幼兔模型。建模成功后，A組為植入0%DBM組；B組為植入10%DBM組；C組為植入20%DBM組；D組為植入40%DBM組；E組為植入80%DBM組。F組為自體骨移植組，該組幼兔取骨缺損模型造模時截取的骨組織原位移植。G組空白對照組僅做骨缺損造模后不做任何處理，直接縫合切口。術后第2周、第4周、第8周分別于各組取4只幼兔進行相關檢測。

1.2.4手術操作:將各組幼兔稱重后麻醉(3%的戊巴比妥鈉1.0 ml/kg耳緣靜脈注射),麻醉成功后,仰臥位固定于動物手術臺上，有前臂備皮后消毒、鋪無菌單，取右前臂橈側切口，彎鉗鈍性分離肌間隙顯露橈骨中段，無菌軟尺測量15 mm缺損長度,手術刀標記兩端截骨點,用線鋸將橈骨中段造成15 mm骨段骨缺損(包括骨膜)，切除尺橈骨骨間膜，同時剝離缺損近端5 mm骨膜,0.9% NaCl溶液沖洗三遍,確定斷端無骨碎片和軟組織后，A～E組將提前制備好的不同比例SF復合DBM修復材料植入對應分組的幼兔橈骨缺損處(A組為植入0%DBM組；B組為植入10%DBM組；C組為植入20%DBM組；D組為植入40%DBM組；E組為植入80%DBM組),再次消毒并縫合切口，F組(自體骨移植組)將骨缺損取出的骨組織以咬骨鉗咬成碎塊后原位移植于骨缺損處，消毒并縫合切口。G組(空白對照組)做截骨骨缺損模型后不做任何處理，直接縫合切口。所有實驗組幼兔術后連續3 d每天肌內注射青霉素50 kU，術后不固定患肢，分籠單獨喂養，自由進食。

1.3觀察項目

1.3.1大體觀察:術后觀察幼兔精神狀態、飲食活動、手術區有無紅腫及膿性分泌物等并記錄。于術后第2周、第4周、第8周隨機將每組幼兔選取2只處死。處死幼兔后由原切口切開并剝離骨膜，切取右橈骨大體標本。觀察絲素蛋白復合DBM材料與周圍組織粘連及骨缺損端與該復合，按照Hitchcock粘連分級進行評分。

1.3.2X線檢測：術后第2周、第4周、第8周對各組幼兔進行線檢查(曝光條件50 kV，90 mA，1.0 S),觀察骨缺損區域骨形成情況，并采用Lane-sandhuX線評分進行評價。

1.3.3成骨分化標志基因(Osteocalcin，CollagenⅠ)的檢測：所有骨標本組織切片，乙醇(80%～100%)進行脫水后，滲透，包埋。然后將標本垂直于短軸鋸成100～200 μm厚的切片，然后手工磨片，最后完成的切片厚度 30～50 μm。骨組織切片常規脫蠟水化后，蘇木素溶液染色1 min，流水沖洗5 min；切片浸入1%鹽酸酒精溶液分化10 s，流水沖洗至在光學顯微鏡下觀察細胞核呈藍色為止；醇溶伊紅溶液染色2 min; 常規步驟脫水透明、封片，于顯微鏡下觀察。骨組織石蠟切片常規脫蠟水化后，去離子水洗3次，5 min/次。將切片置0.01 mol/L枸櫞酸鹽溶液(pH值=6.0)，于60℃水浴過夜孵育(12 h)，進行抗原修復。次日取出切片，自然冷卻至室溫。PBS沖洗3次，5 min/次。使用3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育10 min。PBS洗次，5 min/次。滴加5%正常山羊血清于37℃敷箱孵育1 h。甩去封閉液，滴加骨鈣素或一型膠原一抗溶液(1∶100)，于4℃過夜孵育。PBS洗3次，5 min/次。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗溶液，37℃孵育1 h。PBS洗3次5 min/次。滴加現配的DAB顯色液，于顯微鏡下觀察染色狀態，及時終止。自來水沖洗5 min。蘇木素染液染色1 min。1%鹽酸酒精分化10 s，水洗5 min。常規脫水透明，用中性樹脂封片后觀察骨小梁表面成骨細胞數量變化。

2 結果

2.1大體觀察:術后幼兔無死亡，活動正常，術后10～14 d，所有幼兔傷口均愈合，無明顯感染情況。分別處死各組幼兔，沿原手術切口切開皮膚暴露手術區域，通過大體觀察評估粘連情況。術后2 w：A組、B組、C組、D組、E組、F組幼兔試驗區域骨組織與絲素蛋白復合材料均有輕度粘連，并見到骨痂生長。植入材料均被纖維骨痂包裹粘連，骨缺損斷端有少量骨纖維連接，與周圍組織輕度粘連，較容易分開。G組骨缺損除未見骨痂生長，骨缺損斷端無骨纖維連接，斷端分離。術后4 w：A組、B組、C組、D組、E組幼兔骨缺損處與周圍組織粘連緊密，需借助手術器械分離，見骨痂生長，F組骨痂生長優于D組，D組優于A組、B組、C組、E組，G組骨缺損斷端骨髓腔消失，仍未見骨痂連接。術后8 w：各組均可見新生骨與周圍組織嚴重粘連，F組幼兔骨缺損區域見類骨樣增生，缺損區被大量新生骨填充，與周圍組織粘連緊密。G組骨缺損兩端與周圍組織粘連，缺損兩端形成假關節，無纖維性連接。根據Hitchcock粘連程度分級方法，對以上各組粘連程度進行統計分析統計結果：2 w內各組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，4 w和8 w A組、B組、C組、D組、E組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，與F組、G組比較差異有統計學意義(P<0.05)；不同時間點內各組數據比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組Hitchcock粘連程度計數(n，n=6)

2.2X線檢查結果與分析：分別在術后第2周、第4周、第8周處死幼兔，仰臥位，右前臂外展位拍攝正位片觀察。術后2 w：植入絲素蛋白復合脫鈣骨基質的A組、B組、C組、D組、E組手術區域骨缺損明顯，植入材料未顯影，缺損兩端可見少量骨痂生長，F組見骨痂生長較A組、B組、C組、D組、E組稍多，G組未見明顯骨痂生長。術后4 w：植入復合材料的A組、B組、C組、D組、E組骨缺損面積較2 w時明顯減小，其中A組、B組見少量新骨形成，骨髓腔未見，塑型差；C組、D組、E組、F組見較多新骨和骨痂，D組、F組見骨髓腔形成；G組見少量骨痂形成。術后8 w：植入復合材料的各組骨缺損區與4 w時對比明顯縮小。D組、F組骨缺損區域被新骨和骨痂完全填充，并可見骨皮質塑型，骨折線模糊。A組、B組、C組、E組骨痂和新骨形成較D組、F組少，骨折線可見。G組較4 w時無明顯變化。見表2。

表2 各組Lane-sandhuX線評分

2.3HE染色：術后2 w：各組植入復合材料均出現部分分解吸收，A組見復合材料周圍少量炎性細胞浸潤。斷端見成骨細胞和軟骨細胞，骨缺損處無明顯成骨；B組見植入材料周圍少量孔隙，孔隙內見肉芽組織生長，周圍可見少量骨質形成，斷端見軟骨細胞和成骨細胞；C組、E組見植入材料吸收比A組、B組稍明顯，周圍見少量骨質形成，斷端見新骨生長。D組、F組植入材料與周圍組織空隙小，見塊狀骨質形成，周圍見炎性細胞浸潤，斷端見軟骨細胞、成骨細胞較多，并見到肉芽組織往植入材料孔隙中生長。G組見斷端少量骨樣組織形成。

術后4 w：各組植入復合材料較前進一步分解，斷端見新生骨，復合材料內見肉芽組織生長，復合材料與周圍組織緊密粘連，周圍見較多炎性細胞浸潤。A組復合材料周圍見較多軟骨細胞。B組復合材料與周圍組織之間存在空隙，周圍見骨樣組織形成。C組見復合材料周圍較多新骨形成；D組見復合組織與周圍組織粘連緊密，材料周圍見較多骨細胞和軟骨細胞形成。E組與2 w時比較無明顯變化；F組見復合材料周圍較多骨細胞和軟骨細胞生長；G組斷端有松質骨形成連接。

術后8 w：各組植入復合材料分解較4 w時增加，斷端新骨形成增多，復合材料內均見到肉芽組織生長。A組復合材料與周圍組織之間可見少量間隙，周圍見成骨細胞和炎性細胞；B組復合材料周圍見骨質形成，見少量軟骨細胞；C組見材料和周圍組織緊密包繞生長，周圍新骨較前增多；D組材料周圍見較多骨細胞生長；E組材料和周圍組織之間少量空隙，見較多成骨細胞和少量炎性細胞；F組和D組相識，見較多新骨形成；G組斷端見新骨形成，但未形成骨性連接。

2.4Osteocalci免疫組化結果分析：術后2 w：A組、B組、G組未見陽性顆粒，C組見少量陽性顆粒；D組、E組、F組陽性顆粒相似，均比C組多；G組未見明顯陽性顆粒。術后4 w：A組、B組均見少量陽性顆粒出現，兩組相似；C組陽性顆粒較2 w時增多；D組、E組、F組陽性顆粒較前增多，分布面積較前擴大；G組仍未見陽性顆粒。術后8 w：A～F組材料周圍均可見陽性顆粒，與4 w相比無明顯增多，G組斷端未見明顯陽性顆粒。通過上述結果觀察，所有實驗組骨鈣素在4 w時分泌最旺盛。經比較D組、F組分泌骨鈣素多于其他組(P<0.05)。見表3。

表3 Osteocalci免疫組化結果

2.5Collagen Ⅰ免疫組化結果:術后第2周：A組、B組、C組、D組、E組、F組實驗標本材料均可檢測到不同面積的陽性顆粒。G組未見明顯陽性顆粒。術后第4周：試驗各組檢測結果顯示陽性顆粒面積較前明顯增大，其中D組、F組陽性顆粒面積最大，D組、F組>E組>C組>A組>B組，G組陽性顆粒仍然不明顯。術后第8周：A組陽性顆粒面積和第4周時相似，B組陽性顆粒面積較第4周時增加。C組、D組、E組、F組陽性顆粒面積較第4周略減少。但D組、F組陽性顆粒仍最多。G組斷端陽性顆粒不明顯。根據上述統計結果，CollagenⅠ陽性表達主要發生在第4周和第8周，將具體數據應用非參數軼和檢驗進行比較，統計結果顯示D組、F組較其余實驗組產生CollagenⅠ更多。見表4。

表4 各組Collagen Ⅰ免疫組化結果比較

3 討論

目前臨床上治療大面積骨缺損最佳的治療方法為自體骨移植。但由于供區有限和供區二次創傷等問題，不容易被患者和家屬接受。而異體骨移植和同種異體骨移植主要來源于動物和人骨制品。雖來源廣泛，但術后存在過敏或傳染疾病的風險[3]。自上世紀80年代Vacani開始利用組織工程技術修復治療骨缺損以來，人工生物復合材料作為修復材料填充骨缺損的方法被越來越多的學者重視。然而符合臨床治療要求的人工復合材料需要具有良好的可降解性和生物屬性[4-6]。具有良好的骨誘導性和傳導性，能有利于骨細胞的附著和生長，因此，目前人們仍未找到完全符合臨床要求的骨修復材料[7-8]。本實驗將脫鈣骨基質顆粒與絲素蛋白按照不同比例復合后在幼兔骨缺損模型體內進行實驗，通過對幼兔橈骨大體觀察、影像學檢查、組織學檢查等。并將數據用統計學方法評價修復材料對幼兔橈骨缺損的骨愈合能力。

絲素蛋白(SF)是由天然的纖維蛋白構成，具有優良的降解性能和良好的生物相容性，其降解產物無毒性、低免疫原性和機械強度較高等特點,使許多研究者將成骨種子細胞和絲素蛋白結合起來制備具有骨修復能力的絲素蛋白材料，材料中的絲素蛋白可為細胞生長、黏附和分化提供所需的空間及環境[9-12]。鈣骨基質(DBM)主要應用于骨不連、骨髓炎及良性骨腫瘤刮除后的大段骨缺損，其內含有骨形成蛋白誘導骨修復能力較強[13]，但由于脫去鈣鹽其塑形能力、機械強度變差[14]。有研究表明將支架材料孔徑控制在200～500 μm、孔隙率控制在40%～60%范圍內更加有利于細胞長入[15]。本實驗證實，當脫鈣骨基質和絲素蛋白質量比為40%時，修復材料與骨缺損部位粘連和修復最好，其機制可能是因為質量比為40%時可能材料內部孔徑和孔隙率符合上述最佳范圍，進一步增加DBM比例并不能是SF和DBM更加有效的結合在一起形成合適大小的材料孔徑，從而增強其粘連和修復能力。本實驗沒有設計針對孔徑率的測試，有待后期試驗進一步驗證。

綜上所述，本實驗通過將絲素蛋白和同種異體脫鈣骨基質按不同比例制作復合修復材料。并對幼兔橈骨骨缺損模型進行修復手術移植修復，通過大體觀察、影像學檢查、免疫組化等實驗數據觀察證實：絲素蛋白和脫鈣骨基質復合材料具有良好的成骨能力，且脫鈣骨基質質量為40%時成骨能力和修復能力最佳，可作為大面積骨缺損治療的一種可行性移植材料。