多西環素聯合甲硝唑對脂多糖誘導的子宮內膜炎大鼠炎性因子及TLR4/NF-κB通路的影響

姚 祺，林東梅，林臻影，楊燕燕，莊 躍

(1.廈門大學附屬福州第二醫院婦科，福建 福州 350007；2.福建中醫藥大學動物實驗中心，福建 福州 350007；3.福建醫科大學基礎醫學院，福建 福州 350007)

子宮內膜炎是內膜發生的炎性反應，是育齡女性常見的疾病，嚴重者會出現內膜壞死等，也是流產的主要原因[1]。一般內膜炎是由細菌感染所致，革蘭陰性菌是感染的主要致病菌，而脂多糖(LPS)是其外膜主要成分，也是誘發子宮內膜炎的關鍵因素[2]。病原微生物侵入體內，聚集在子宮內膜，釋放大量毒素，引發炎性反應，攻擊人體免疫系統，嚴重危害患者身體健康[3-4]。多西環素和甲硝唑屬于廣譜抗生素，對于治療子宮內膜炎具有良好作用，但針對二者聯合用于子宮內膜炎的報道較少。為進一步了解其機制，特建立大鼠模型，通過對比研究，對聯合用藥價值展開分析。

1 資料與方法

1.1試驗動物及分組：健康SPF級SD大鼠50只(8～12周齡雌鼠)，體重(180±20)g，隨機分為對照組、模型組、多西環素組、甲硝唑組、聯合組，每組各10只大鼠。本次實驗經過本院動物倫理委員會同意。

1.2大鼠子宮內膜炎模型構建:①大鼠全身麻醉：除空白組以外的其余4組用適量麻醉藥劑(速眠新注射液0.67 ml/kg)在大鼠腿肌肉后側進行肌內注射，5～10 min后大鼠進入全身麻醉狀態，維持1～2 h。②灌注LPS：得到的全身麻醉大鼠倒提，采用大鼠子宮灌注，向子宮內推注2.5～5 ml/kg的脂多糖，灌注量為20 μl/只；灌注后保持倒立姿勢1～2 min，采用適當的背腹部按摩，有助于灌注液均勻分布。灌注12～24 h后可成功建立大鼠子宮內膜炎模型。

1.3試驗分組:第2天開始給予藥物，1次/d，連續給藥14 d。具體給藥方式如下：①多西環素組：按30 mg/(kg·d)灌胃多西環素片(國藥準字H32021676，常州制藥廠有限公司生產，0.1 g/d)；②甲硝唑組：按20 mg/(kg·d)灌胃甲硝唑[國藥準字H20003083，金日制藥(中國)有限公司生產，規格：0.2 g]；③聯合用藥組：灌胃多西環素30 mg/(kg·d)+甲硝唑20 mg/(kg·d)；④模型組：灌胃同等體積無菌生理鹽水;⑤空白組：不作任何處理。

1.4子宮組織樣本采集:最后一次給藥2 h后處死大鼠并剪開腹腔，抽取5 ml動脈血，離心機(3 000 r/min)離心15 min后分離得到上層血清，在-80℃冰箱保存過夜。用藥組無菌環境下處死大鼠取子宮組織，分成兩份，用多聚甲醛固定并保存于-80℃冰箱中。

1.5檢測項目

1.5.1血清炎性因子檢測:根據酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明操作，檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-6(IL-6)水平。

1.5.2宮腔病理變化:蘇木素-伊紅染色法(HE染色)觀察子宮組織，將固定的子宮組織按常規方法制備石蠟切片，HE染色鏡檢觀察。病理觀察指標有：①子宮腔有無粘連、擴張；②子宮內膜是否有壞死細胞；③子宮壁是否有炎性細胞浸潤；④子宮內膜是否有充血和水腫。根據病變程度從輕到重計分為0～4分，0分為無病變，1分為極輕度，2分為輕度且病變范圍<1/3，3分為中度病變且病變范圍介于1/3～2/3，4分為重度病變，病變范圍>2/3。炎性細胞浸潤程度積分：0分為無炎性細胞浸潤，1分為極少量炎癥細胞，2分為黏膜固有層有少量，3分為肌層查見，4分為全層都有炎性細胞。累積病變程度和炎性反應細胞浸潤程度積分，總分數越高表明子宮腔炎癥程度越嚴重。

1.5.3Western印跡檢測子宮組織核因子κB p65(NF-κB p65)、Toll樣受體4(TLR4)水平:收集子宮組織，采用RIPA裂解液低溫提取總蛋白。二辛可寧酸(BCA)法測定總蛋白量，于6%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝胺電泳(SDS-PAGE)行組織蛋白電泳，轉于聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，根據目的蛋白選擇相應的條帶，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜后加入稀釋過的一抗NF-kB p65(1∶500稀釋)、TLR4(1∶600稀釋)和β-actin(1∶5 000稀釋)，4℃孵育過夜，二抗反應。取出聚偏氟乙烯膜，化學發光法獲得膠片后進行圖像采集，目標條帶A值采用QuantityOne凝膠圖像軟件分析，以目標條帶與β-actin條帶A值的比值作為活性NF-κB p65、TLR4相對表達量。

2 結果

2.1血清炎性因子水平:模型組IL-2水平高于空白組，TNF-α、IL-4、IL-6水平低于空白組；聯合用藥組TNF-α、IL-4、IL-6水平均低于模型組，IL-2高于模型組，且聯合用藥組TNF-α、IL-4、IL-6低于多西環素組、甲硝唑組，IL-2高于多西環素組、甲硝唑組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6表達及子宮內膜病理程度評分

2.2宮腔病理變化：空白組結構清晰，子宮內膜正常，無炎性細胞浸潤；模型組組織壞死，上皮細胞脫落，較多炎性細胞浸潤，內膜下方部分血管彎曲、粗大；多西環素組結構規整，組織輕度水腫、較致密，細胞分布均勻，偶有血管微微擴張，損傷較輕；甲硝唑組存在少許炎性細胞，無明顯滲血，內膜損傷較少；聯合用藥組：子宮內膜有少許損傷，無滲血，無細胞浸潤，炎性反應好轉。見圖1。與空白組相比，模型組的病理綜合評分顯著高于空白組；聯合用藥組的病理綜合評分低于模型組，且低于多西環素組、甲硝唑組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 大鼠子宮宮腔病理變化(炎性細胞：藍色箭頭；血管擴張：黃色箭頭，HE，×200)

2.35組子宮組織NF-κB p65、TLR4蛋白水平對比：模型組NF-κB p65、TLR4相關蛋白表達量均高于空白組；聯合用藥組NF-κB p65、TLR4均低于模型組，且聯合用藥組NF-κB p65、TLR4低于單獨用藥組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組相關蛋白表達量

3 討論

子宮內膜炎是產后子宮內部的炎癥反應，一般由細菌感染所致，多發生于月經期、分娩后，感染后導致子宮出血、不孕、流產等。感染常見病原體有革蘭陰性菌，其外膜主要成分為LPS，LPS是誘發內膜炎的重要原因。為此，建立動物模型模擬女性子宮內膜炎感染后的情況，能夠有效預防和對預后有重大的意義[5]。臨床上，治療子宮內膜炎主要是消除現有炎性反應，保證生育的連續性，抗生素和殺菌劑運用到子宮內膜炎中，但治療方案仍然是當前研究的主題。相關資料[6]顯示，多西環素及甲硝唑聯用對LPS誘導的大鼠子宮內膜炎具有保護作用。蔡忠群[7]的研究顯示，采用甲羥孕酮片聯合甲硝唑治療子宮內膜炎的有效率為95.83%。本研究采用多西環素聯合甲硝唑治療大鼠子宮內膜炎，結果顯示兩者聯合運用會明顯緩解子宮內膜損傷、壞死、細胞浸潤等，改善子宮內膜組織受損。

子宮內膜上皮細胞是抵抗外來病菌的第一道防線，在阻止內膜炎發病中占據著重要的地位[8]。研究表明[9]，Toll樣受體識別細菌的病原體對于免疫系統發揮免疫功能顯得尤為重要，TLR4是一種關鍵受體，能夠激活NF-κB轉位，調控并參與下游炎性反應。IL-2作為抗炎因子，IL-2水平越高患者身體內炎性反應水平越低，兩者呈負相關。此外，IL-2作為評估免疫功能的重要指標，其本質上免疫調節因子，輔助T細胞參與免疫反應，引導Lak細胞產生抗體，同時促使T細胞增殖，加強NK細胞的殺菌消炎作用[10]。TNF-α也是一種炎性因子，自身存在毒性，同時也促進炎性細胞產生毒素，釋放膠原酶，進一步危害人體免疫細胞，使得人體免疫功能下降，機體內的炎性反應越多，TNF-α、IL-4、IL-6水平升高與炎性水平呈正相關。多西環素是治療子宮內膜炎的常用抗菌藥物，其作用機理是通過抑制蛋白質合成發揮抑菌作用，改變細胞膜通透性，且耐藥性較小。甲硝唑屬于硝基唑衍生物，可以阻斷機體內細菌核酸合成，有效抑制細菌生長和繁殖，降低細菌數量，且能清除陰道細菌，發揮強效抗菌消炎作用，同時能夠促進抗炎因子IL-2的分泌，共同發揮效果，促進患者康復[11]。本研究結果與張瑞等[12]的研究結果相一致，進一步證實了多西環素聯合甲硝唑用藥，通過影響TLR4/NF-κB信號通路，抑制TLR4/NF-κB激活，可以有效抑制炎性因子，和改善炎性指標。

綜上所述，多西環素聯合甲硝唑治療子宮內膜炎可以有效改善子宮組織受損情況，參與調節炎性因子活性，抑制TLR4及NF-κB激活，進一步發揮理想的治療效果。