牡丹籽粕總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

陳 晨，張煥新，王海波，江 娟

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 食品科技學(xué)院，江蘇泰州 225300）

油用牡丹品種“鳳丹”，由于出油率較高、結(jié)籽較多、適應(yīng)性能力較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被視為食用油的良好來源[1]。2011年，牡丹籽油被作為一種健康營養(yǎng)的新型資源食品而備受青睞，但生產(chǎn)過程中，牡丹籽粕作為附屬品卻被直接丟棄，造成資源的虛耗和環(huán)境的破壞[2]。因此，研究牡丹籽粕中的功能性成分，對提高牡丹籽的綜合利用率有著重要的影響意義。

牡丹籽粕中富含脂肪酸、多酚、多糖和黃酮類化合物等。其中的黃酮類物質(zhì)抗氧化性極強(qiáng)，還具有穩(wěn)定膽固醇、抗菌抗病毒等作用。本文以牡丹籽粕“鳳丹”為原材料，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化牡丹籽粕總黃酮物質(zhì)的提取工藝條件，還研究了牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)對DPPH 自由基、羥基自由基及超氧陰離子自由基的清除能力，考察其抗氧化能力，為進(jìn)一步開發(fā)和利用牡丹籽粕奠定了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

“丹鳳”牡丹籽殼，眾達(dá)合作社基地。

無水乙醇、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉、蘆丁（HPLC ≥98%）和石油醚（30～60 ℃），上海沃凱生物技術(shù)有限公司。

T6 紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；RE-52D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；KQ-250B 超聲波清洗機(jī)，上海錦玟儀器設(shè)備有限公司；Labconoo FreeZone 6 L 型臺式凍干機(jī)，廣州賽拓儀器科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡丹籽粕預(yù)處理

將牡丹籽粕置于粉碎機(jī)中粉碎，過80 目篩。取適量牡丹籽粉加石油醚于60 ℃恒溫水浴鍋中索氏抽提10 h。脫脂完成、晾干后放入45 ℃的烘箱中，低溫烘干8 h，取出冷卻到室溫，備用。

1.2.2 牡丹籽粕總黃酮提取物制備

準(zhǔn)確稱取1.0 g 牡丹籽粕，將牡丹籽粕粉與乙醇混合均勻。置于超聲波清洗器中超聲輔助提取，提取完成之后，將提取液過濾。濾液在65 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至無溶液蒸出，冷凍干燥，制成提取物凍干粉，冷藏備用。

1.2.3 牡丹籽粕總黃酮得率測定

用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[3-4]測定牡丹籽粕總黃酮物質(zhì)含量，以蘆丁為標(biāo)品，于510 nm 處測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法。精確量取0.1 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL 和0.60 mL 置于5 mL 離心管，分別加入2 mL 蒸餾水及0.15 mL 5%NaNO2溶液，攪拌均勻，放置6 min，添加0.15 mL 10% Al(NO3)3·9H2O 溶液，5 min 后添加2 mL 4%的NaOH 溶液，再將體積固定到5 mL，搖勻后靜置30 min，于510 nm 處測量吸光值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品總黃酮提取率的測定。精確稱量10 mg 的牡丹籽粕總黃酮提取物，加入蒸餾水定容至10 mL，充分振蕩搖勻后過濾。棄去初濾液，精準(zhǔn)吸取2 mL續(xù)濾液，用制作標(biāo)曲的方法測定樣品。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，黃酮提取率計(jì)算公式為

式中：X為根據(jù)回歸方程所得總黃酮含量，μg；V1為提取總黃酮所用溶液的總體積，mL；V2為測定總黃酮時(shí)所用的體積，mL；M為加入牡丹籽粕醇提物質(zhì)量，mg。

1.2.4 單因素與正交實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱量1.0 g 的牡丹籽粕若干份，分別考察料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70（g∶mL），乙醇濃度為40%、50%、60%、70%和80%，超聲功率為200 W、250 W、300 W、350 W 和400 W，超聲溫度為20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃以及超聲時(shí)間為30 min、40 min、50 min、60 min 和70 min對總黃酮提取率的影響。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以牡丹籽粕總黃酮的提取率為考察指標(biāo)，在乙醇濃度為60%、超聲溫度為40 ℃的條件下，選用A超聲功率、B超聲時(shí)間以及C料液比進(jìn)行L9(33)的正交實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化牡丹籽粕中的總黃酮提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.5 牡丹籽粕總黃酮體外抗氧化性測定

在上述正交實(shí)驗(yàn)得出最佳工藝條件后，在此條件下制備牡丹籽粕總黃酮，并分別測定其對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力。

（1）DPPH 自由基清除率的測定。將牡丹籽粕總黃酮制成0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的待測樣品溶液，分別取3.0 mL 樣品溶液，加入1 mL 0.2 mmol·L-1的DPPH 乙醇溶液，并攪拌均勻，在常溫下避光放置30 min 后，于517 nm 波長下測定其吸光度值A(chǔ)i[5]；以3.0 mL 無水乙醇替代樣品作為空白組，其余處理同上，測定吸光度值為A0；以1 mL 無水乙醇代替DPPH 乙醇溶液作為對照組，其余處理同上，測定吸光度值A(chǔ)j。以相同質(zhì)量濃度的維生素C 溶液作為陽性對照。DPPH 自由基清除率的計(jì)算公式為

（2）羥基自由基清除率測定。分別取2 mL 0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的牡丹籽粕總黃酮樣品溶液，再分別加入2 mL 2 mmol·L-1的FeSO4溶液、2 mL 1 mmol·L-1的H2O2溶液、3 mL 6 mmol·L-1的水楊酸溶液以及2 mL 的蒸餾水于試管中，并混合均勻，37 ℃水浴30 min，于517 nm 波長下進(jìn)行吸光度值測定，記為A2[6]；空白組不加樣品溶液，其他處理同上，測吸光度值記為A0；用蒸餾水替代水楊酸溶液，所測吸光度值記為A1。以相同質(zhì)量濃度的維生素C 溶液作為陽性對照。羥基自由基清除率的計(jì)算公式為

（3）超氧陰離子自由基清除率的測定。取6.0 mL Tris-HCl（50.0 mmol·L-1，pH 8.2）于試管中，25 ℃水浴20 min，分別加入2.0 mL 0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的牡丹籽粕總黃酮溶液，再添加0.8 mL 5.0 mmol·L-1的鄰苯三酚溶液，搖勻，25 ℃水浴4 min，使用0.2 mL HCl 溶液（8 mol·L-1）終止反應(yīng)，在320 nm 處測定吸光度記為Ai；以70%聚乙二醇溶液替代樣品溶液作為空白組，吸光度為A0；以蒸餾水替代鄰苯三酚作為對照組，吸光度為Aj。以相同質(zhì)量濃度的維生素C 溶液作為陽性對照。超氧陰離子自由基清除率的計(jì)算公式為

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

用Minitab 17 軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和回歸分析，用SPSS 23 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，通過Origin 2018 和Excel 繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對牡丹籽粕總黃酮提取率的影響

由圖1（a）可知，料液比對牡丹籽粕總黃酮提取率的影響較大。料液比過小，總黃酮提取不夠充分。料液比過大時(shí)，總黃酮得率降低，易造成雜質(zhì)也被提取出來，影響提取物的純度[7]。在料液比為1∶50（g∶mL）時(shí)，牡丹籽粕中的總黃酮含量最高。由圖1（b）可知，隨著乙醇濃度的升高，總黃酮提取率先升高后下降。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮的提取率最高，為9.92%。當(dāng)乙醇濃度較高時(shí)，牡丹籽粕的醇溶性和脂溶性物質(zhì)的溶出量增大，影響黃酮類物質(zhì)的溶出，從而導(dǎo)致黃酮得率的降低[8]。如圖1（c）所示，當(dāng)超聲功率為250 W 時(shí)，總黃酮提取率最高，達(dá)到10.96%。當(dāng)逐漸加大超聲功率時(shí)，由于過大的功率造成了強(qiáng)烈的分子運(yùn)動，使得大分子雜質(zhì)也被加速溶解出來，影響黃酮提取率[9]。如圖1（d）所示，若超聲溫度過低時(shí)，總黃酮的提取效率低。若超聲溫度過高，黃酮類物質(zhì)易受高溫破壞，影響其生物活性和穩(wěn)定性。當(dāng)超聲溫度為40 ℃時(shí)，總黃酮提取率最高。如圖1（e）所示，當(dāng)超聲時(shí)間在30～50 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，牡丹籽粕與酒精充分混合，加速了黃酮類物質(zhì)溶解。當(dāng)超聲時(shí)間為50 min 時(shí)，總黃酮提取率最高，可達(dá)10.76%。但超聲時(shí)間超過50 min 后，會出現(xiàn)黃酮分解或其他大分子溶解現(xiàn)象，導(dǎo)致總黃酮提取量逐漸降低。

圖1 各因素對牡丹籽粕總黃酮提取率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，影響牡丹籽粕總黃酮提取量的3個因素中，超聲功率的作用最大，料液比次之，超聲時(shí)間作用最小，即A＞C＞B。根據(jù)K值大小可知，牡丹籽粕總黃酮提取的較優(yōu)方案是A2B2C2，即超聲功率250 W，超聲時(shí)間50 min，液料比1∶50（g∶mL）。

表2 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對表2的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得出總黃酮提取率的回歸公式為Y= 10.584 4+0.002 2A1+0.458 9A2-0.461 1A3-0.024 4B1+ 0.085 6B2-0.061 1B3-0.127 8C1+0.302 2C2-0.174 4C3，對上述回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

由表3可知，超聲功率、超聲時(shí)間以及料液比對總黃酮提取率的影響均顯著（P＜0.05）。由F值大小可以看出，影響牡丹籽粕蛋白質(zhì)得率的因素的大小順序?yàn)锳＞C＞B，即超聲功率＞料液比＞超聲時(shí)間。

在乙醇濃度為60%，超聲溫度為40 ℃，超聲功率為250 W，超聲時(shí)間為50 min，料液比為1∶50的條件下，重復(fù)進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，牡丹籽殼總黃酮提取率為（11.50±0.13）%，說明此提取工藝可靠，具有參考價(jià)值。

2.4 牡丹籽粕總黃酮提取物的體外抗氧化活性測定結(jié)果

2.4.1 牡丹籽粕總黃酮對DPPH 自由基清除力的影響

由圖2可知，在當(dāng)牡丹籽粕總黃酮提取物濃度低于0.8 mg?mL-1時(shí)，其清除率隨著提取液濃度的增大而增加。當(dāng)提取物濃度為0.8 mg?mL-1時(shí)，DPPH自由基清除率最高，為78.71%。當(dāng)提取物濃度高于0.8 mg?mL-1時(shí)，DPPH 自由基的清除效果趨于平穩(wěn)。此外，牡丹籽粕總黃酮DPPH 自由基清除能力高于維生素C 溶液。

圖2 牡丹籽粕總黃酮對DPPH 自由基清除率的影響

2.4.2 牡丹籽粕總黃酮對羥基自由基清除力的影響

羥基自由基是一種機(jī)體內(nèi)的重要活性氧，其能夠和細(xì)胞內(nèi)各種有機(jī)物進(jìn)行反應(yīng)，通過破壞脂肪、蛋白質(zhì)和核酸代謝來損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，從而將其分解、降解，最終清除[10]。由圖3可知，牡丹籽總黃酮提取物質(zhì)量濃度在0.1～0.6 mg·mL-1時(shí)，對羥基自由基的清除率逐漸增加。當(dāng)提取物濃度在0.6 mg·mL-1時(shí)，清除率為45.83%。隨著總黃酮提取物濃度的繼續(xù)增加，其對羥基自由基的清除率影響不大。與維生素C 溶液相比，牡丹籽粕黃酮提取物對羥基自由基的清除能力稍弱，但也具備一定的清除作用。

圖3 牡丹籽粕總黃酮對·OH 清除力的影響

2.4.3 牡丹籽粕總黃酮對超氧陰離子自由基清除力的影響

由圖4可知，牡丹籽粕總黃酮提取物濃度在0.1～0.4 mg·mL-1時(shí)，其清除·O2-的能力緩慢增加。在0.4～0.8 mg·mL-1的質(zhì)量濃度下，其清除速率呈現(xiàn)直線上升趨勢，最高達(dá)57.62%。而后隨著總黃酮提取物質(zhì)量濃度的不斷提高，其清除速率基本保持不變。此外，牡丹籽粕總黃酮對?O2-的清除能力總體弱于維生素C 溶液。

圖4 牡丹籽粕總黃酮對?O2-清除力的影響

3 結(jié)論

本研究通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，確定了牡丹籽粕總黃酮的最佳提取工藝。在料液比為1∶50，乙醇濃度為60%，超聲功率為250 W，超聲溫度為40 ℃，超聲時(shí)間為50 min 條件下提取，牡丹籽粕中的總黃酮提取率為（11.50±0.13）%。

根據(jù)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，牡丹籽粕黃酮提取物對DPPH 自由基、羥基自由基以及超氧陰離子自由基均有良好的清除能力，說明牡丹籽粕黃酮類提取物有著很好的抗氧化性能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為牡丹籽粕的綜合開發(fā)利用提供了理論支持，為研究牡丹籽粕中活性物質(zhì)奠定了一定的基礎(chǔ)。