MS-222麻醉劑在珍珠龍膽石斑魚體內(nèi)殘留消除規(guī)律的研究

尤 揚，黃 和，黃伊彤，陳彩燕，李鈺娟，黃錦嫻

（廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088）

珍珠龍膽石斑魚作為常見水產(chǎn)品之一，在運輸過程中常由于應(yīng)激反應(yīng)過強使其受到損傷甚至死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失，因此在石斑魚的長途運輸過程中，商家會對其使用漁用麻醉劑。在實際運輸中，需要建立既可以在短時間內(nèi)麻醉石斑魚又保證其復(fù)蘇后存活率的有效麻醉濃度，保證長時間運輸?shù)母叽婊盥蔥1]。漁用麻醉劑被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的捕捉、運輸、取樣等經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)和科學(xué)研究，能夠有效地降低水產(chǎn)動物的應(yīng)激反應(yīng)，可提高水產(chǎn)動物的存活率[2]。MS-222 是目前世界范圍內(nèi)廣泛使用的漁用麻醉劑[3]。適量的MS-222 能抑制魚的反射和活動能力，使魚呼吸減慢、行動遲緩，達(dá)到減少代謝及耗氧的目的，從而進(jìn)入休眠狀態(tài)，適用于長途運輸[4]。

不同類型水產(chǎn)品的麻醉效果和代謝MS-222 的速度不同，導(dǎo)致消除期各異[5]。但是，針對MS-222麻醉劑在魚類中的殘留與消除規(guī)律的研究較少，目前尚未有石斑魚中MS-222 殘留代謝規(guī)律的研究報道。因此，本試驗利用MS-222 麻醉劑對石斑魚進(jìn)行保活麻醉試驗，用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測石斑魚中MS-222 麻醉劑殘留量，探討MS-222 麻醉劑在石斑魚不同部位殘留消除規(guī)律，為保障MS-222 麻醉劑使用的安全性和政府制定MS-222 在水產(chǎn)品中殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

MS-222，純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯、分析純，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；氯化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鎂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-丙基乙二胺固相吸附劑（Primary Secondary Amine Sorbent，PSA），上海麥克林生化科技有限公司；十八烷基吸附劑（Octadecyl C18Sorbent，C18ODS），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石墨化碳黑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.22 μm 微孔有機濾膜，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

凝膠色譜-氣質(zhì)聯(lián)用儀（島津，日本）；高速冷凍臺式離心機（賽默飛，美國）；全自動平行氮吹儀（睿科，中國）。

1.2 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：DB-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：起始溫度100 ℃，保持2 min，以10 ℃·min-1升到200 ℃，保持2 min，再以25 ℃·min-1升到終止溫度275 ℃，保持5 min；流速：1.2 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：280 ℃，不分流進(jìn)樣；離子源溫度：270 ℃。

（2）質(zhì)譜條件。離子源溫度：270 ℃；溶劑延遲：3 min；采集方式：選擇離子監(jiān)測（SIM）模式；MS-222 的定性離子碎片：92m/z、120m/z、137m/z、165m/z，其中120m/z為定量離子，各離子豐度比（%）為81∶100∶37∶72。

1.3 試驗方法

1.3.1 有效麻醉濃度選擇試驗

為模擬運輸情況和復(fù)蘇后的存活情況，將MS-222 標(biāo)準(zhǔn)品加入水箱中稀釋成濃度為80 mg·L-1、120 mg·L-1、200 mg·L-1和300 mg·L-1的30 L 麻醉藥液。每個濃度設(shè)置5 尾石斑魚，在充氣補氧的條件下將石斑魚麻醉24 h，撈出沖洗表面后放入水箱中復(fù)蘇，計算存活率，根據(jù)結(jié)果確定適合長時間麻醉的MS-222 濃度。

1.3.2 石斑魚中MS-222 殘留試驗

為研究MS-222 在石斑魚肌肉和肝臟中的殘留情況，根據(jù)1.3.1 中確定的有效濃度，于水箱中配制濃度為120 mg·L-1的MS-222 麻醉藥液30 L，在水箱中放入9 尾石斑魚，每隔3 h 隨機取出1 尾石斑魚，共計24 h。取樣時用潔凈海水沖洗石斑魚表面殘留的藥液，避免影響試驗結(jié)果。將石斑魚去皮，取出肌肉和肝臟，分別進(jìn)行均質(zhì)處理。將所取得的樣品于-20 ℃凍藏，等待樣品處理提取MS-222，使用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定MS-222 含量。

1.3.3 石斑魚中MS-222 消除試驗

進(jìn)行MS-222 殘留試驗后，測定石斑魚在120 mg·L-1的MS-222 麻醉藥液中浸浴24 h 后的消除情況。于配制的30 L 麻醉藥液水箱中放入9 尾石斑魚，將石斑魚在MS-222 麻醉液中藥浴24 h 后，將所有石斑魚放入清潔海水中進(jìn)行消除試驗，不斷充氣。在復(fù)蘇過程中分別在0 h、2 h、5 h、10 h、16 h、24 h、36 h、48 h 和72 h 這9 個時間點隨機選取1 尾石斑魚，將石斑魚去皮，取出肌肉和肝臟，分別進(jìn)行均質(zhì)處理。將所取得的樣品于-20 ℃凍藏，等待樣品處理提取MS-222，使用氣相色譜質(zhì)譜儀測定MS-222 含量。

1.3.4 樣品處理

將冷藏的肝臟和肌肉樣品自然解凍，稱量2.0 g左右的樣品（已均質(zhì)的石斑魚肌肉/肝臟）于50 mL離心管中，加入2 mL 蒸餾水，旋渦1 min。加入10 mL 乙腈，渦旋3 min 后，超聲萃取10 min。在50 mL 離心管中加入1.5 g 氯化鈉，手搖混勻，再加入2 g 無水硫酸鎂，手搖混勻，4 000 r·min-1離心5 min。吸取上清液并全部轉(zhuǎn)移至另一裝有300 mg 無水硫酸鎂+100 mg PSA+100 mg C18+20 mg 石墨化碳黑的15 mL 離心管中，手搖混勻，4 000 r·min-1離心5 min。吸取上清液至氮吹管中，氮吹至管壁濕潤近干。用2 mL 乙酸乙酯復(fù)溶，充分溶解后吸取濃縮液，0.22 μm 微孔有機濾膜過濾入進(jìn)樣小瓶，后上機檢測。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗所得數(shù)據(jù)通過Excel 整理并繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效麻醉濃度選擇結(jié)果及分析

對于魚類的麻醉時期，不同學(xué)者對其有不同的分期。本試驗將石斑魚在實際麻醉試驗中的呼吸頻率及幅度、平衡性、尾鰭動作等行為特征作為麻醉分期的標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合其他文獻(xiàn)中對魚類麻醉的分期方法，將MS-222 對石斑魚的麻醉過程分為5 個階段：輕度鎮(zhèn)靜期（麻醉1 期）、深度鎮(zhèn)靜期（麻醉2 期）、輕度麻醉期（麻醉3 期）、深度麻醉期（麻醉4 期）以及延髓麻醉期（麻醉5 期）。

于試驗設(shè)定的4 個濃度麻醉藥液中各放入5 條石斑魚，浸浴24 h 后，放入30 L 潔凈海水箱中復(fù)蘇，若石斑魚復(fù)蘇1 h 后仍然不能恢復(fù)呼吸即認(rèn)定為死亡，若不能回到正常游動狀態(tài)只能側(cè)身游動即認(rèn)定為癱瘓。石斑魚在不同MS-222 濃度下浸浴24 h 后的成活率見表1。

表1 石斑魚在不同MS-222 濃度下浸浴24 h 后的成活率表

由表1可知，當(dāng)麻醉藥液濃度為200 mg·L-1和300 mg·L-1時，石斑魚全部僵直死亡。麻醉藥液濃度為80 mg·L-1的石斑魚，由于適應(yīng)環(huán)境及代謝作用，長時間麻醉后恢復(fù)到麻醉1 期。石斑魚游動時會互相傷害甚至死亡，不適用于實際運輸。麻醉藥液濃度為120 mg·L-1時，石斑魚可長時間維持于麻醉4 期，此狀態(tài)下可實現(xiàn)高密度且長時間運輸。綜上所述，MS-222 對石斑魚的有效麻醉濃度確定為120 mg·L-1。

2.2 石斑魚中MS-222 殘留試驗結(jié)果及分析

用濃度為120 mg·L-1的MS-222 進(jìn)行麻醉殘留試驗，按照1.3.2 中所確定的時間點采集石斑魚樣品，分別取肌肉和肝臟進(jìn)行勻漿處理。采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定麻醉石斑魚肌肉和肝臟中MS-222 的殘留量，結(jié)果見圖1。

圖1 石斑魚肌肉和肝臟中MS-222 的殘留情況圖

隨著麻醉時間的延長，MS-222 在石斑魚肝臟和肌肉中含量呈快速上升又逐漸下降，后有輕微上升的趨勢，最后基本穩(wěn)定。其中在石斑魚肌肉中，前9 h 的殘留量呈直線上升，在9～21 h 肌肉中MS-222 含量逐漸下降，但在21～24 h 殘留量又小幅度上升，最大殘留濃度為55.68 mg·kg-1。在石斑魚肝臟中，前9 h 的殘留量增長迅速，在9～18 h 肝臟中MS-222 含量逐漸下降，但在18～24 h 間殘留量又再上升，最大殘留濃度為93.39 mg·kg-1。可見石斑魚肝臟中的MS-222 殘留量大于肌肉，肝臟和肌肉殘留曲線趨勢大致類似。第24 h 的肌肉中MS-222 殘留濃度為18.73 mg·kg-1，肝臟中MS-222 殘留濃度為28.43 mg·kg-1。

2.3 石斑魚中MS-222 消除試驗結(jié)果及分析

將石斑魚在120 mg·L-1的MS-222 麻醉藥液中藥浴24 h 后，將所有石斑魚放入潔凈海水中進(jìn)行消除試驗，在消除過程中不斷充氣，于不同時間點隨機選取1 尾石斑魚進(jìn)行MS-222 濃度的測定。72 h 內(nèi)MS-222 在石斑魚不同部位殘留量見圖2。

圖2 石斑魚肌肉和肝臟中MS-222 的消除情況圖

隨著消除時間的延長，MS-222 在石斑魚肌肉和肝臟中的濃度在10 h內(nèi)呈先升高后逐漸降低的趨勢。在前2 h 內(nèi)，肌肉殘留量出現(xiàn)小幅度升高，最高殘留濃度為20.56 mg·kg-1。而肝臟在前5 h 內(nèi)，出現(xiàn)大幅度的重吸收現(xiàn)象，最高殘留濃度達(dá)到66.40 mg·kg-1。在石斑魚肌肉MS-222 消除試驗中，消除時間為24 h時的MS-222 殘留濃度為2.08 mg·kg-1，而消除時間為48 h 時MS-222 殘留量低于檢測限；在肝臟中，5～10 h 內(nèi)MS-222 的消除速度極快，消除時間為48 h 時MS-222 殘留濃度為0.05 mg·kg-1，而消除時間為72 h 時MS-222 殘留量低于檢測限。石斑魚肝臟與肌肉的MS-222 消除曲線相似，其中肌肉在48 h時MS-222 殘留量降低到檢測限以下，即完全消除，而肝臟在48 h 時MS-222 殘留量極小，在72 h 時MS-222 殘留量降低到檢測限以下，即完全消除。

3 結(jié)論

通過MS-222 有效麻醉濃度選擇試驗和分析石斑魚麻醉后樣品中MS-222 殘留量，得出以下結(jié)論。

（1）通過24 h 麻醉及復(fù)蘇試驗，對比4 個濃度MS-222 麻醉藥液浸泡石斑魚的成活率和癱瘓率，得出MS-222 有效麻醉濃度為120 mg·L-1。

（2）將石斑魚在濃度為120 mg·L-1的MS-222 麻醉藥液中進(jìn)行24 h 的藥浴處理，MS-222 在石斑魚不同組織中殘留有差異，肌肉中的最高殘留濃度可達(dá)到55.68 mg·kg-1，而在肝臟中的殘留量比肌肉高，最高殘留濃度可達(dá)到93.39 mg·kg-1。在MS-222 濃度為120 mg·L-1的消除試驗中，MS-222 在石斑魚肝臟中完全消除時間比肌肉長，肌肉需要48 h，肝臟為72 h。