貯存條件和滅菌次數對平板計數瓊脂培養基的影響

宋 洋

（寧德市食品藥品檢驗檢測中心，福建寧德 352100）

食品安全歷來備受人們的重視，食品中微生物污染能夠影響食品安全[1-2]。人體攝入被微生物污染的食品后，容易引起食源性疾病，危害人們的身心健康。食品微生物檢驗是運用微生物學的理論和實驗方法，對食品中所含微生物的種類、數量、性質及其對人體的健康的影響進行判斷，進而判別食品是否符合質量標準的檢驗方法。開展食品微生物檢驗可以在一定程度上保障食品安全，食品中微生物菌落總數檢驗項目是食品微生物檢驗的常見項目，作為評價食品微生物污染狀況的指標之一，可以直觀反映食品中微生物數量[3-4]。為了開展食品中微生物菌落總數檢驗項目，實驗室經常會使用到平板計數瓊脂培養基（Plate Count Agar，PCA），但在實際工作中，存在平板計數瓊脂培養基配制過多，實驗后剩余培養基保存后能否再次使用的問題[5]。實驗研究不同的貯存條件和滅菌次數對PCA 培養基質量的影響，判斷其是否符合《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》（GB 4789.28—2013）要求[6]。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸埃希氏菌 CMCC（B）44102（批號：220218；產品號：33053；規格：500～1 000 CFU/顆），來自北京三藥科技開發公司；金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003，（批號：220216；產品號：33025；規格：500～1 000 CFU/顆），來自北京三藥科技開發公司；枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501（批號：220812；產品號：33031；規格：500～1 000 CFU/顆），來自北京三藥科技開發公司。

1.2 培養基

平板計數瓊脂培養基（PCA）（批號：1100441），廣東環凱微生物有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）（批號：1103601），廣東環凱微生物有限公司。

1.3 儀器設備

MLS-3751L-PC 高壓蒸汽滅菌器，日本三洋電子科技有限公司；GNP-9270 型隔水氏恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；HFsafe-1200 生物安全柜，上海力申科學儀器有限公司；HYC-940 醫用冷藏箱青島海爾股份有限公司；YP3002 電子天平，余姚金諾天平儀器有限公司；PHS-3C型pH計（E-201-P平面pH 復合電極），上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 培養基的處理方法

（1）培養基配制及滅菌方法。準確稱取平板計數瓊脂培養基（PCA）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA），加入對應量的超純水，煮沸至溶解，121 ℃高壓滅菌15 min。

（2）培養基滅菌方法。第1 d 配制兩份PCA 培養基并分別編1 號和2 號，滅菌后，取出自然冷卻，將1 號放入常溫潔凈環境存放3 d，將2 號放入潔凈冰箱4 ℃存放3 d，第4 d 配制3 號PCA 培養基并滅菌，待3 號自然冷卻后，與新配制的4 號PCA 培養基一起放入滅菌，滅菌后自然冷卻3 號和4 號，再將3 號、4 號與新配制的5 號PCA 培養基和TSA 培養基一起滅菌，隨后將1 號和2 號沸水浴加熱融化。上述培養基每份大約配制150 mL。

1.4.2 培養基性能測定

（1）理化特性。①外觀性狀。平板計數瓊脂培養基的色澤、均勻度等變化。②pH 值。培養基滅菌或融化后倒入無菌平皿制成平板，冷卻至25 ℃時，測定平板上3 個不同位置的pH 值，取其平均值。③培養基質量。準確稱取空瓶質量、滅菌前加入培養基后質量、滅菌后培養基的質量、貯存后培養基的質量。④質量減少率。培養基質量減少率=培養基減少的質量/培養基滅菌前質量，培養基減少質量=滅菌后減少質量+貯存過程減少質量。

（2）生長特性。①菌落總數。用無菌生理鹽水溶解稀釋菌株至每0.1 mL 含菌數為100～150 CFU，分別吸取菌懸液0.1 mL，均勻涂布接種于待測平板和參比平板。每一稀釋度接種兩個平板，置于（36±1）℃培養48 h，對菌落總數進行計數。②生長率。生長率測試是GB 4789.28—2013 中培養基和試劑的質量控制的測試方法。按規定用適當方法將適量測試菌株的工作培養物接種至固體、半固體和液體培養基中，每種培養基上菌株的生長率應達到GB 4789.28—2013所規定的最低限值，生長率數值越大說明培養基越適合該種菌株的生長。PCA 培養基作為非選擇性分離和計數固體培養基，按GB 4789.28—2013 中非選擇性分離和計數固體培養基的目標菌（質控菌株）生長率定量測試方法，PCA 培養基質控菌株生長率（PR）=Ns/No，且應不小于0.7。其中，Ns為待測PCA 培養基平板上質控菌株菌落總數，CFU；No為參比（TSA）培養基平板上質控菌株菌落總數，CFU，該菌落總數應≥100 CFU。PCA 培養基質控菌株生長率定量測試中所用的質控菌株分別為大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。

2 結果與分析

2.1 培養基理化特性測定結果和分析

按照1.4.2（1）方法，每次滅菌后觀察培養基外觀變化，測定25 ℃時的pH 值并稱重，結果見表1。由表1可知，1 號、2 號、5 號PCA 培養基滅菌1 次后常溫保存3 d、4 ℃保存3 d、滅菌后現用對培養基滅菌后的質量、pH、外觀影響不大；由5 號、4 號、3 號可知，PCA 培養基隨著滅菌次數變多，滅菌后培養基的質量變小，pH 值下降，培養基顏色加深，但均一度不變，也未見渾濁。這主要由于高溫滅菌導致培養基水分蒸發，質量變少，同時培養基中少部分還原糖類與氨基酸化合物高溫下發生美拉德反應[7-8]，生成有色物質，影響培養基顏色，水分減少。此外，高溫可讓部分培養基成分發生變化，導致pH 下降但變化不大。

表1 PCA 培養基經不同處理后的理化特性結果

2.2 培養基生長特性測定結果與分析

2.2.1 菌落總數

按照1.4.2（2）方法，用不同質控菌株分別進行菌落總數的測定，結果見圖1。

圖1 不同處理條件下PCA 培養基質控菌株的菌落總數

由圖1可知，3 株質控菌株在5 種處理條件下的PCA 培養基平板上的菌落總數存在差異，滅菌1 次后現用且未經過保存3 d 處理條件下的PCA培養基上3 種質控菌株的菌落總數均為最高。由5號、4 號、3 號可知，隨著PCA 培養基滅菌次數增加3 種質控菌株的菌落總逐漸減少，滅菌3 次的PCA 培養基上質控菌株的菌落總數最低；由1 號、2 號、5 號可知，相比滅菌1 次現用處理條件下的培養基，PCA 培養基滅菌1 次后常溫保存3 d 和4 ℃保存3 d 處理條件下的3 種質控菌株的菌落總數減少。

2.2.2 生長率測定結果與分析

按GB 4789.28—2013 要求，PCA 培養基質控菌株的生長率PR≥0.7。由表2可知，3 種質控菌株分別在經5 種不同處理條件后的PCA 培養基上的生長率都能達到PR≥0.7 的要求。說明這些處理對PCA 培養基質量影響較小，仍滿足培養基的質量標準要求。

表2 不同處理條件下PCA 培養基的生長率結果

3 結論

《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》（GB 4789.28—2013）是關于培養基質量要求方面現行有效的國家標準。此標準規定了培養基的質量應符合的基本要求和微生物學要求。其中基本要求包括培養基外觀、色澤、均一性和pH 等方面；微生物要求指生長特性，包括生長率、選擇性兩方面。若培養基的基本要求和微生物學要求均符合規定，則該批培養基可被接受，能夠滿足實驗需要。

實驗把食品微生物檢驗中經常使用的非選擇性培養基中的PCA 培養基當作研究對象，改變滅菌后PCA 培養基的貯存條件或滅菌次數，按GB 4789.28—2013 對培養基質量的要求，進行了pH 值、色澤、均一度和質量等理化性質以及質控菌株生長情況和生長率的測定。結果表明，PCA 培養基滅菌后在常溫保存3 d、4 ℃保存3 d、滅菌3 次的質量都能符合GB 4789.28—2013 要求，滿足實驗需求，不會影響培養基的性能，可能是由于PCA 培養基組成成分簡單、穩定，滅菌后放置貯存再融化和重復滅菌不易破壞有效成分，且PCA 培養基為非選擇性分離和計數固體培養基，極其適合微生物生長，所以微生物對PCA培養基質量要求降低。

上述實驗結果應用在實際工作中，可將實驗剩余PCA 培養基放置于潔凈或無菌環境保存，短期內可滅菌或直接融化后再次使用，便于節省PCA培養基。同時，若實驗室預先配制并貯存PCA 培養基也能夠幫助解決因滅菌設備不足無法短期內完成大批量檢驗任務的問題，進一步提高實驗便利性。但從實驗結果也可以看出，滅菌1 次現用的PCA 培養基最適合微生物生長，所以日常開展實驗中仍盡可能采用這種方式處理培養基。但是，不是所有培養基經過上述條件處理后都仍能滿足實驗需要。不同培養基的組成成分不同，有些培養基組成成分復雜、不穩定，不能重復滅菌，或者有些培養基的組成成分在貯存過程中容易自行降解，甚至不同廠家不同批次的同一培養基也存在成分或質量差異，所以需要根據具體培養基的類別和性質開展實驗驗證后，才能確定貯存條件或滅菌次數對該培養基質量的影響。此外，貯存培養基的環境應盡量保持潔凈或無菌，貯存過程也應進行信息登記，才能保證培養基的質量。