運用PCR定量分析植物蛋白飲料中杏仁源性成分的研究

龐 婕，胥小榮，孔慶巖，劉 杰

（承德市食品藥品檢驗檢測中心，河北承德 067000）

承德處在燕山山脈，盛產杏仁，承德杏仁顆粒飽滿，肉厚而細，以此杏仁為原料，加入水、白糖等以特有工藝制作承德杏仁露，不僅香味獨特，功效也較多。杏仁里含有黃酮及多酚類物質，該物質能夠降低人體內膽固醇的含量[1]，因此杏仁露深受中老年人的喜愛。杏仁露中蛋白質、多種維生素及微量元素等含量比較高，具有一定的保健功能[2]。隨著人們生活水平的提高，杏仁露也受到越來越多人的喜愛和關注，然而部分不法商販為了牟取暴利在食品中摻雜摻假，因此建立準確、有效的杏仁源性成分的定量檢測方法意義重大。

目前，PCR 定量方法是根據樣品最終擴增產物進行定量分析，通常用凝膠電泳法進行分離，并用熒光染色來檢測。但在PCR 反應中，由于反應體系和反應條件等因素會影響PCR 反應效率，甚至出現一些非特異性擴增產物，用終點法來衡量源性成分含量不夠精確。實時熒光定量PCR 是指在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累對整個PCR 進程進行實時檢測，在PCR 反應過程中，隨著循環數的增加，PCR 產物量增加[3]。相應的熒光信號強度也跟著增強，同時不斷地收集熒光信號。隨著反應的進行，根據檢測到的熒光信號可以得到一條以循環數（Cycle Threshold，Ct）為橫坐標和熒光強度（△Rn）變化為縱坐標的“S”形熒光擴增曲線[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

純杏仁，購自承德市寬廣超市；10 個不同品牌的杏仁露，分別購自承德市八縣三區，每個品牌購買一個批次。

1.1.2 試劑

植物基因組DNA 提取試劑盒，廣州雙螺旋基因技術有限公司；杏仁原性成分核酸檢測試劑盒（PCR熒光探針法），廣州雙螺旋基因技術有限公司。

1.2 儀器與設備

實時熒光定量PCR 儀-CFX96，美國伯樂；離心機- FC5714，德國OHAUS；渦旋混勻儀-HY-2，上海儀電科學儀器股份有限公司；榮冠（HH）數顯恒溫水浴鍋，常州賽普實驗儀器廠；Eppendorf（D30）核酸蛋白測定儀，艾本德。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

將杏仁置于干燥箱中80 ℃，4 h 烘干后，用液氮或研磨儀勻漿后制成細小的粉末狀。加水制成杏仁溶液。進行稀釋，得到10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1、60 mg·L-1、70 mg·L-1、80 mg·L-1、90 mg·L-1及100 mg·L-1的溶液。此樣品用作后續實驗的標準品；杏仁露進行均質后分裝于玻璃容器內。

1.3.2 DNA 提取

①轉移100 μL 樣品至2.0 mL 離心管中，加入1 200 μL Buffer ATL 和5 μL RNase A，渦旋使樣品充分分散。65 ℃處理10 min，期間渦旋混勻1 次。②加入420 μL Buffer PS 至樣品中，渦旋20 s 混勻。冰上放置10 min。10 000 r·min-1離心5 min。③小心轉移600 μL 上清液至新的離心管中，加入900 μL Buffer PBD（已加乙醇）至樣品中，渦旋混勻20 s。④把DNA 結合柱裝于2 mL 收集管中。轉移混合液至柱子中，10 000 r·min-1離心30～60 s。⑤倒棄濾液把柱子裝回收集管，將剩余液體轉移至柱子中，10 000 r·min-1離心30～60 s。⑥倒棄濾液把柱子裝回收集管。加入600 μL Buffer GW2（已用乙醇稀釋）至柱子中，10 000 r·min-1離心60 s。⑦倒棄濾液把柱子裝回收集管。10 000 r·min-1離心2 min 去除柱子中殘留的乙醇。⑧將柱子轉移至新的1.5 mL 離心管中。加入30～50 μL 預熱到65 ℃的Buffer AE 至柱子的膜中央，65 ℃靜置2 min。10 000 r·min-1離心2 min。⑨重復步驟8 的洗脫操作。丟棄DNA 結合柱，DNA 保存于-20 ℃或-80 ℃[5]。

1.3.3 特異性引物和探針

參照國家市場監督管理總局發布的“食品補充檢驗方法”，杏仁源和真核生物18sRNA 內參照檢測用引物和探針如表1所示[6]。

表1 引物和探針序列

1.3.4 反應程序

將購買的商品化試劑盒放置在室溫待解凍后，1 000 r·min-1離心30 s 后揭開封口膜，向每管反應液中分別加入4 μL 模板，順序為空白、陰性對照、待測樣品模板、陽性對照。蓋好配套的PCR 管蓋后，渦旋混勻30 s，離心1 min，立即進行PCR 擴增反應。擴增反應條件為①去污染：37 ℃，10 min，一個循環。②預變性：95 ℃，5 min，一個循環。③擴增：95 ℃，15 s；60 ℃，60 s。40個循環。在60 ℃時收集熒光信號，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇NONE。擴增曲線如圖1所示。

圖1 擴增曲線圖

1.4 Ct 值與DNA 濃度的關系

利用已知質量濃度的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct 值，即可從標準曲線上計算出該樣品的DNA 濃度。對標準品進行稀釋，選擇10 個稀釋度為模板進行實時熒光PCR 擴增，制作Ct 值與標準品濃度的標準曲線。

1.5 杏仁質量濃度與DNA 濃度的關系

對10 個稀釋度的標準品分別進行DNA 提取，之后用核酸蛋白測定儀對所提取的DNA 進行測定，記錄每個稀釋度測定的DNA 濃度。每個梯度實驗進行3 次重復。

1.6 樣品檢驗

待測樣品進行DNA 提取后，進行PCR 擴增，得到擴增的Ct值，通過Ct值與DNA濃度的線性關系，求出樣品的DNA 濃度，再根據樣品的DNA 濃度求出樣品質量濃度。

2 結果與分析

2.1 Ct 值與DNA 濃度的實驗結果

Ct 與DNA 濃度呈線性關系，DNA 濃度越高，只需要比較少的循環數就可以使擴增產物達到閾值，這樣Ct 值就比較小。相反，DNA 濃度越小，就需要較多的循環數才能使擴增產物達到閾值，這樣Ct 值就較大。根據實驗測得的10 個稀釋度的標準品的Ct值和DNA 濃度關系如圖2所示。

圖2 Ct 與DNA 濃度呈線性關系

2.2 杏仁質量濃度與DNA 濃度的實驗結果

對樣品制備中10 個稀釋度的標準模板按照1.3.2的方法進行DNA 提取，之后用核酸蛋白測定儀對所提取的DNA 進行測定，記錄每個樣品的DNA 濃度。每個濃度實驗進行3 次重復實驗，并對實驗結果進行線性擬合，根據實驗結果生成相關系數曲線，見圖3，杏仁的相關性系數R2為0.997。

圖3 杏仁質量濃度與DNA 濃度關系

2.3 方法驗證實驗結果

取3 個已知質量濃度的樣品，提取DNA 后，取4 μL 進行熒光定量PCR 反應，進行重復測定，將實驗結果帶入本研究建立的計算公式中進行計算。結果顯示，測得值與標準值的相對誤差較小，在方法學范圍內，最大相對誤差為9.12，見表2。通過對已知DNA 濃度樣品的檢測，說明該方法可以用于杏仁制品的檢測。

表2 已知樣品檢測結果

2.4 方法與實際應用

利用所建立的方法對所采購的10 個不同品牌的杏仁露進行檢測分析，樣品進行平行實驗，實驗結果取平均值。測得10 個樣品中有2 個樣品杏仁質量濃度低于5%，1 個樣品杏仁質量濃度為0，其余均為20%以上。結果說明目前市面上銷售的杏仁露確實存在摻假售假的情況。

2.5 注意事項

由于實時熒光檢驗過程中靈敏度較高，實驗操作過程要求很高，且實驗花費也高，為了得到更加準確的結果，嚴格按照相應標準要求進行，注重實驗細節。①熒光定量PCR 檢測靈敏度高，為了防止交叉污染，實驗操作場地要進行合理分區，一般分為第一區：試劑準備區；第二區：樣本制備區；第三區：擴增及產物分析區，并按要求設置正負壓。②在實驗過程中，不同的實驗分區要穿戴好專用的無菌服和一次性乳膠手套，不同的分區要使用專用的移液器等實驗儀器和設備。③實驗過程中，試劑要放置于冰盒上，避免強光照射，防止熒光淬滅。④所有試劑要加到反應管底部，盡量不要沾到管壁上，反應體系配制完畢后要低速離心數秒，避免產生氣泡。⑤在操作過程中，盡量不要在PCR 反應管上做任何標記，不要用手碰到PCR 反應管上部的采光部分，以免影響實驗結果。⑥結束實驗后，實驗中用到的相應設備，只要不怕水和腐蝕的，都用有效氯消毒液進行浸泡或擦拭，最后用清水洗凈或擦凈的方法來清潔，操作臺要進行紫外線照射。

3 結論

本研究采用實時熒光定量PCR 方法探索杏仁露中杏仁的定量方法，通過建立DNA 濃度和Ct 值、杏仁質量濃度和DNA 濃度之間的線性關系，就可以根據未知樣品的Ct 值計算出未知樣品中杏仁的質量濃度，建立杏仁源性成分的定量方法。該方法能檢測杏仁露中的微量帶入或故意摻假問題，為常規化源性成分檢測提供新的思路。同時，其他源性成分的檢測也可以參照此方法，為其他植物蛋白飲料的日常檢驗提供了有利的科學依據。實時熒光定量PCR 具有特異性強，靈敏度高的優點。其相對于傳統PCR 來說更無需進行后續的凝膠電泳實驗，縮短實驗時間，提高實驗效率。但熒光定量PCR 也存在很多不足之處。①用來定量的標準曲線，需要自己制備，各個實驗室所用的標準品沒有統一的標準，所以每個實驗室制作的標準曲線區別較大，缺少可比較性。②由于實驗操作的要求，對實驗場地要求很高，同時實驗過程中需要消耗大量一次性耗材，這就導致了實時熒光定量PCR 實驗成本的提高。