LC-MS/MS法測(cè)定火鍋底料中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因含量的不確定度評(píng)定

劉應(yīng)琪，楊延康，伏 華，胡 艷，謝鳳梅，靳澤榮*

（1.四川敏恩檢測(cè)技術(shù)有限公司，四川成都 610000；2.成都圣恩生物科技股份有限公司，四川成都 610000）

火鍋?zhàn)鳛橹袊?guó)傳統(tǒng)美食，在我國(guó)的歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。火鍋因其麻辣鮮香的特點(diǎn)給人們以獨(dú)特的味覺(jué)享受，再加上吃火鍋的過(guò)程本身帶有一定的社交屬性，備受人們喜愛(ài)，同時(shí)麻辣火鍋底料產(chǎn)品的出現(xiàn)也推動(dòng)了麻辣火鍋的發(fā)展，使火鍋行業(yè)呈現(xiàn)一片欣欣向榮的景象[1-3]。火鍋底料是以動(dòng)物油（如牛油、羊油）或植物油（如菜籽油、大豆油、玉米油）、辣椒、豆瓣、花椒、姜和蒜等為主要原料，經(jīng)炒制而形成的一種復(fù)合調(diào)味料[4]。

嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁等為生物堿類物質(zhì)，人體食用后會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的依賴性，危害身心健康[5-11]。2008年12月原衛(wèi)生部發(fā)出《關(guān)于開(kāi)展全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治的緊急通知》，明確將其列為非法添加物，且標(biāo)注其可能被添加的食品為火鍋、火鍋底料等[12]。

測(cè)量不確定度是指根據(jù)用到的信息，表征賦予被測(cè)量量值分散性的非負(fù)參數(shù)[13]。檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性予以把控，且有能力對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)估；當(dāng)檢測(cè)方法有規(guī)定或檢測(cè)結(jié)果接近限值要求時(shí)，檢測(cè)報(bào)告須提供測(cè)量結(jié)果的不確定度[14-21]。目前，測(cè)定嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁等生物堿類物質(zhì)的方法有多種[22-24]，本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)《測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南》（CNAS—GL05:2011）[25]及《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL06:2006）[26]，建立不確定度評(píng)估模型，識(shí)別測(cè)定過(guò)程中不確定度來(lái)源，評(píng)估各不確定度分量并合成得到標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度。

1 材料與方法

1.1 儀器

液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，1290-6460，安捷倫科技有限公司；電子天平（感量為0.000 1 g），ME204E，梅特勒-托利多公司；電子天平（感量為0.000 01 g），MS105，梅特勒-托利多公司；離心機(jī)，HR/T20MM，湖南赫西儀器裝備有限公司；超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；渦旋混合器，XW-80A，上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試劑與材料

火鍋底料：市售；嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因標(biāo)準(zhǔn)溶液：批號(hào)21081223，壇墨質(zhì)檢；甲醇、乙腈、甲酸：色譜純，F(xiàn)isher；鹽酸、甲酸銨、氫氧化鈉、無(wú)水醋酸鈉和無(wú)水硫酸鈉：分析純，成都科隆化工有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）填料：粒度40～70 μm；C18填料：粒度40～50 μm。

1.3 試驗(yàn)方法

參照《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（DB 31/2010—2012）測(cè)定。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用乙腈稀釋成罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度分別為1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1，嗎啡、可待因濃度分別為5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、25.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和100.0 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取2 g 樣品于50 mL 聚四氟乙烯具塞離心管中，加入150 μL 同位素內(nèi)標(biāo)工作液，再加入10 mL 水，振搖使分散均勻，加入15 mL 乙腈，渦旋振蕩1 min，加入6 g 無(wú)水硫酸鎂和1.5 g 無(wú)水醋酸鈉的混合粉末，迅速振搖，渦旋振蕩1 min，以4 000 r·min-1離心5 min，取上清液待凈化。

稱取（50±5）mg PSA，（100±5）mg 無(wú)水硫酸鎂，（100±5）mg C18粉末置于2 mL 聚四氟乙烯具塞離心管中，移取1.5 mL 上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，以10 000 r·min-1離心2 min，移取上清液，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，取濾液待測(cè)。

1.3.3 液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

色譜柱：BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），或相當(dāng)者；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；流動(dòng)相：A 相為含0.1%甲酸的乙腈，B 相為含0.1%甲酸的10 mmol·L-1甲酸銨溶液。

1.4 測(cè)量模型

火鍋底料中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因含量測(cè)定的計(jì)算公式為

式中：X為試樣中各待測(cè)物的含量，μg·kg-1；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出的供試品溶液中各待測(cè)物的濃度，μg·L-1；V為樣液的提取體積，mL；m為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源的識(shí)別

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法及建立的測(cè)量模型，識(shí)別其引入的不確定度主要有樣品的精密度產(chǎn)生的不確定度、通過(guò)回收率表示的準(zhǔn)確性產(chǎn)生的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度、定容體積引入的不確定度及樣品質(zhì)量引入的不確定度（表1）。

表1 各不確定度分量的類型及概率分布

通過(guò)將以上識(shí)別出的各不確定度分量進(jìn)行評(píng)定，得出各分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，并進(jìn)行合成。在95%的置信水平下，計(jì)算擴(kuò)展不確定度，最終得到測(cè)定火鍋底料中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因含量的不確定度。

2.2 各分量的不確定度評(píng)定

2.2.1 精密度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

樣品的測(cè)量過(guò)程受樣品均勻性、操作人員的技術(shù)能力、設(shè)備的分辨率和穩(wěn)定性以及試劑耗材的質(zhì)量水平等因素影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的多次重復(fù)，評(píng)定其精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，可綜合體現(xiàn)樣品均勻性、人員操作技能等多種因素的隨機(jī)影響。按照試驗(yàn)方法，對(duì)樣品重復(fù)測(cè)定6 次，通過(guò)A 類評(píng)定的方式評(píng)定樣品測(cè)試的精密度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，計(jì)算公式為

表2 樣品重復(fù)測(cè)定結(jié)果

2.2.2 準(zhǔn)確度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

樣品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度可通過(guò)在樣品中加標(biāo)得到的回收率來(lái)體現(xiàn)。分別對(duì)每個(gè)物質(zhì)進(jìn)行3 個(gè)濃度水平的添加，每個(gè)濃度水平分別重復(fù)2 次，計(jì)算加標(biāo)回收率，通過(guò)A 類評(píng)定的方式評(píng)定樣品測(cè)試的準(zhǔn)確度所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，計(jì)算公式為

測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3 樣品回收率測(cè)定值

2.2.3 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品質(zhì)量濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差。采用5 個(gè)不同濃度水平點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將每個(gè)濃度點(diǎn)分別測(cè)定2 次，得到相應(yīng)的峰面積，并用最小二乘法擬合求出一元回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算公式為

測(cè)定結(jié)果如表4所示。

（2）使用擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品質(zhì)量濃度過(guò)程中所引入的不確定度。按照試驗(yàn)方法，對(duì)樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)定6 次，測(cè)得樣品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的含量見(jiàn)表2，則按下列公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

就是說(shuō)，在教室里，在大庭廣眾之下，學(xué)生們都會(huì)受到群體氛圍的影響，這會(huì)使學(xué)生的言行舉止變得似乎更加可氣可惱。

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)可知，本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度見(jiàn)表5，按照B 類評(píng)定方法、均勻分布模式，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中所用量器引入的不確定度：本實(shí)驗(yàn)采用10 mL 容量瓶配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）規(guī)定，其允許誤差為±0.02 mL，按三角分布計(jì)算，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中溫度變化引入的不確定度：假設(shè)標(biāo)準(zhǔn)溶液溫度與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度（20 ℃）溫差為5 ℃，水在20 ℃的膨脹系數(shù)為0.000 21 ℃-1，則不確定分量為

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按下式計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.2.5 樣品處理過(guò)程中所用量器造成體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

樣品處理過(guò)程中所用量器造成體積的不確定度主要來(lái)源為量器的準(zhǔn)確性及溫度變化兩個(gè)方面。量器的準(zhǔn)確性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量ur,a(V)，可根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）規(guī)定容量允差按三角分布計(jì)算，實(shí)際操作過(guò)程中溶液溫度與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度（20 ℃）不同引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur,b(V)，已知水的膨脹系數(shù)為0.000 21 ℃-1，按均勻分布求得，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 體積引起的相對(duì)不確定度

2.2.6 樣品稱量過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

根據(jù)電子天平的使用說(shuō)明書(shū)及檢定證書(shū)，當(dāng)稱樣量≤50 mg 時(shí)，天平的最大允許誤差為±0.5 mg，稱取樣品量為2 g，天平分辨率為0.1 mg，按照B 類評(píng)定均勻分布方法，則樣品稱量過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成

將上述各不確定度分量進(jìn)行合成，則嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

2.4 相對(duì)擴(kuò)展不確定度評(píng)定

取置信概率為95%，k=2，則嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的相對(duì)擴(kuò)展不確定度分別為

Urel1=k×urel(Y1)=2×0.043 80=0.087 60

Urel2=k×urel(Y2)=2×0.032 98=0.065 96

Urel3=k×urel(Y3)=2×0.041 38=0.082 76

Urel4=k×urel(Y4)=2×0.044 28=0.088 55

Urel5=k×urel(Y5)=2×0.042 35=0.084 70

2.5 擴(kuò)展不確定度

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，樣品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的含量分別為74.919 7 μg·kg-1、74.545 0 μg·kg-1、14.993 1 μg·kg-1、15.679 4 μg·kg-1、15.466 8 μg·kg-1，其擴(kuò)展不確定度為

嗎啡：U1=74.919 7×0.087 60=6.563 0 μg·kg-1

可待因：U2=74.545 0×0.065 96=4.916 9 μg·kg-1

罌粟堿：U3=14.993 1×0.082 76=1.240 8 μg·kg-1

那可丁：U4=15.679 4×0.088 55=1.388 5 μg·kg-1

蒂巴因：U5=15.466 8×0.084 70=1.310 1 μg·kg-1

2.6 結(jié)果表示

根據(jù)不確定度的評(píng)估，火鍋底料中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測(cè)定結(jié)果分別為X1=（74.919 7±6.563 0）μg·kg-1，k=2；X2=（74.545 0±4.916 9）μg·kg-1，k=2；X3=（14.993 1±1.240 8）μg·kg-1，k=2；X4=（15.679 4±1.388 5）μg·kg-1，k=2；X5=（15.466 8±1.310 1）μg·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

LC-MS/MS法測(cè)定火鍋底料中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因含量測(cè)量不確定度評(píng)定結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，對(duì)嗎啡而言，準(zhǔn)確度引入的不確定度貢獻(xiàn)最大，對(duì)可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因而言，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程引入的不確定度貢獻(xiàn)最大，樣品稱量過(guò)程引入的不確定度對(duì)總的不確定度貢獻(xiàn)最小。因此，在日常檢測(cè)過(guò)程中，檢測(cè)人員應(yīng)注意選購(gòu)質(zhì)量穩(wěn)定、準(zhǔn)確度等級(jí)較高的標(biāo)準(zhǔn)品，加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程操作的規(guī)范性，同時(shí)使用經(jīng)過(guò)計(jì)量檢定的合格器皿。從檢測(cè)的各個(gè)方面加強(qiáng)質(zhì)量管控，降低各不確定度分量，提高結(jié)果準(zhǔn)確度和有效性。

圖1 測(cè)量不確定度分量示意圖