小反芻獸疫病毒反向遺傳學研究進展

2022-12-29 11:46:28陳延飛劉偉潔薛青紅

中國獸藥雜志 2022年2期

關鍵詞：研究

王煜，孫淼，陳延飛，劉偉潔，薛青紅

(中國獸醫藥品監察所, 100081)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起山羊、綿羊等小反芻獸的一種急性、熱性、接觸性傳染病，是OIE法定報告的動物傳染病，我國規定為Ⅰ類動物疫病[1]。據FAO推測，全球約有62.5%的小反芻動物受到小反芻獸疫的威脅，特別是非洲、亞洲和中東地區。2007年7月我國西藏地區首次發生疫情，2013年11月新疆地區再次發生，隨后疫情遍布全國大多數省份。據不完全統計，全球每年因PPR導致的經濟損失高達約30億美元，目前主要采用疫苗免疫接種對PPR進行預防，2015年OIE、FAO聯合啟動了《全球小反芻獸疫控制與根除策略》,提出了到2030年在全球消滅PPR的目標[2]。

1 小反芻獸疫病毒概述及復制特征

小反芻獸疫病毒屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)，同屬成員還包括麻疹病毒(Measles virus， MV)、牛瘟病毒(Rinderpest virus, RPV)、犬瘟熱病毒(Canine Distemper virus，CDV)、海豹瘟熱病毒(Phocine distemper virus,PDV)、鯨麻疹病毒(Cetacean morbillivirus,CMV)、海豚麻疹病毒(Dolphin morbillivirus,DMV)[3-4]。通過基因序列比對，可將PPRV分為四個基因型，但PPRV只發現一個血清型，其中基因I、II、III型主要流行于非洲，而我國小反芻獸疫流行毒株屬于基因Ⅳ型。PPRV是單股負鏈不分節段有囊膜的RNA病毒，絕大多數PPRV的核苷酸總數為15948 nt，RNA鏈從3’至5’依次分布著N-P-M-F-H-L 6個基因，共編碼6種結構蛋白，即核衣殼蛋白(Nucleoprotein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基質蛋白(Matrixprotein，M)、融合蛋白(Fusion protein，F)、血凝素蛋白(Hemagglutinin protein，H)、大蛋白(Large protein，L)，此外PPRV P 基因有兩個重疊的開放性閱讀框(ORF)可編碼病毒結構蛋白P和非結構蛋白C、V蛋白[5]。

PPRV復制過程中其病毒粒子中單鏈核糖核苷酸(ssRNA)不能直接用作轉錄和復制的模板，只有當基因組ssRNA與核蛋白結合形成核衣殼復合物(RNPs)以后，才能被RNA依賴的RNA聚合酶識別并作為轉錄的模板轉錄成正鏈RNA，以此作為mRNA翻譯PPRV復制所需蛋白，與此同時，以正鏈RNA為模板生成負鏈的病毒基因組RNA。

與麻疹病毒屬其它成員一樣，PPRV基因組也遵循“六堿基原則”，即病毒基因組長度為6的倍數。但有研究表明，在微突變的PPRV微型基因組中插入或敲除一到兩個核苷酸，PPRV也能正常復制[6]，PPRV的這一獨特特征有別于其它嚴格遵守“六堿基原則”的麻疹病毒。

2 反向遺傳學概述及研究進展

廣義的反向遺傳學指從生物基因組及所含生物信息出發，在獲得生物基因信息的基礎上，通過對基因的操作，如定點突變、插入、缺失、置換等，進行生物基因結構和功能的研究。目前，反向遺傳技術已經成為推動植物學、動物學、微生物學研究發展的最前沿科學之一。

狹隘的反向遺傳學是指對微生物的反向遺傳操作和研究，目前已有很多病毒的反向遺傳操作系統被建立起來，用以研究病毒的生命周期，了解病毒復制過程中的機制，創新了新型疫苗的研究手段，開創了病毒學研究的新局面。

由于基因組結構相對簡單，反向遺傳學在RNA病毒的研究中應用最為廣泛，其核心是建立病毒的感染性克隆，即病毒的人工構建。了解病毒的基因組結構特點和表達調控模式是開展RNA病毒反向遺傳學研究的基礎[7]。隨著分子生物學的發展，這項技術隨后也應用于DNA病毒的研究，病毒DNA可以直接進入細胞合成感染性病毒粒子。1976年研究人員通過在體外轉染突變過的猴空泡病毒40 (Simian vacuolating virus 40 or Simian virus 40，SV40)DNA實現了“體外拯救”[8]。1978年，科學家們將QB噬菌體全長cDNA克隆到載體上并轉染大腸桿菌，成功拯救出具有感染性的子代噬菌體[9]。這一突破性進展為其他RNA病毒的反向遺傳學研究奠定了基礎。1981年，脊髓灰質炎病毒(Poliovirus，PV)感染性克隆的成功構建拉開了動物RNA病毒反向遺傳學研究的序幕[10]。

相對于DNA病毒和正鏈RNA病毒，負鏈RNA病毒的反向遺傳學研究比較滯后。由于其基因組RNA不是復制、轉錄和翻譯的模板，必須與核衣殼蛋白、RNA依賴性RNA聚合酶等形成核糖核蛋白復合物(RNPs)，才能進行正常的復制，完成病毒粒子的包裝，而這在體外是難以實現的。除此之外，構建負鏈RNA病毒的全長cDNA必須明確基因組末端序列。綜上所述，體外拯救具有感染性的負鏈RNA病毒存在一定難度[11-12]。直到1989年，Luytjes W等成功拯救出一種嵌合的流感病毒，打開了負鏈RNA病毒反向遺傳學研究的大門[13]。

3 PPRV反向遺傳學研究進展

關于MV、RPA、CDV的反向遺傳操作系統的研究早已見諸報道[14-16]，而PPRV反向遺傳操作系統的建立則相對較晚。2007年Bailey D等人[17]構建了小反芻獸疫病毒微型基因組系統，這一體系證實了PPRV反向遺傳操作系統的可行性，并且證明了PPRV不像其他副粘病毒一樣嚴格遵守“六堿基原則” 。微型基因組一般保留病毒的順式作用元件和調控區(一般為病毒基因組兩端非編碼區)，多使用GFP、CAT、X-gal等報告基因代替中間編碼區，而且都是將報告基因反向連入啟動子下游，以避免非特異性表達。PPRV體外拯救基本元件包括反基因組轉錄全長cDNA載體以及三個反式作用輔助病毒蛋白：核衣殼N，磷蛋白P和大蛋白L。Yununs等人建立了PPRV體外轉錄系統，該系統可以在體外持續地轉錄出病毒所有蛋白的mRNA，并表現出梯度轉錄特性，與病毒自然感染細胞的情況相似[18]。翟軍軍[19]構建了PPRV全長cDNA克隆，進行了PPRV DNA疫苗的研發和免疫學研究。直到2012年，Hu等人[20]通過RNA聚合酶II啟動子驅動病毒全長基因組轉錄的方式，第一次成功地從PPRV全長cDNA克隆中拯救出了能穩定表達綠色熒光蛋白(GFP)的重組病毒，其體外復制能力與親本病毒相當。2015年Muniraju M等人[21]也成功拯救出PPRV，該拯救系統采用人工合成的質粒，包含全長PPRV反基因組序列和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因序列。該研究通過插入EGFP基因獲得了陽性標記的重組病毒，通過突變H基因上C77位點獲得了陰性標記的重組病毒，為PPRV鑒別感染和免疫(DIVA)標記疫苗的研發提供了新的思路和方法。在上述兩個成功拯救PPRV的系統中，親本毒均為PPRV Nigeria 75/1 疫苗株，被拯救的重組PPRV病毒與親本毒在Vero細胞上的生長曲線沒有明顯差別且產生相同的細胞病變(CPE)。Hu等人重組rPPRV-GFP病毒通過病毒中和試驗(VNT)可以更快速、更高通量地檢測PPRV中和抗體效價。Muniraju M等用重組病毒候選疫苗(rPPRV-C77)與親本毒疫苗同時免疫山羊，都對致死劑量的PPRV攻擊提供了完全保護。2019年Liu F等人[22]也建立了PPRV反向遺傳系統，拯救的PPRV能在體外高效表達EGFP。研究通過檢測表達EGFP的細胞比例，比較了BHK21、F81、MDBK、RK13、MDCK、PK15、Vero和GT等8個哺乳動物細胞系對拯救病毒的易感性，最終確定Vero最易感，PK15最不易感。

研究者根據副粘病毒基因組遺傳穩定的特點，常利用反向遺傳技術制備重組副粘病毒載體疫苗和DIVA疫苗，已成為當今疫苗研發的重要方向。胡倩倩等人[23]構建了能夠表達藍舌病毒VP5和VP7蛋白的重組PPRV，接種山羊可誘導產生針對BTV和PPRV的抗體。Yin C等人[24]構建了能夠表達口蹄疫病毒VP1蛋白的重組PPRV(rPPRV/VP1)，rPPRV/VP1接種山羊后對口蹄疫病毒的攻擊產生明顯的保護，結果表明rPPRV/VP1可作為PPRV和FMDV活載體疫苗的候選株。雖然已有成功建立的PPRV反向遺傳系統，但至今未有公開報道拯救出的PPRV應用在PPR的防控和疫病的根除。

4 PPRV拯救策略

4.1 副粘病毒反向遺傳操作系統的分類目前，副粘病毒反向遺傳操作系統主要分為兩種：一種是基于T7 RNA聚合酶建立的反向遺傳操作系統，另一種是基于RNA聚合酶II建立的反向遺傳操作系統。兩個操作系統的建立都必須以轉錄出精確的全長序列為基礎。研究表明，負鏈RNA病毒在體外進行拯救的過程中，病毒基因組前導序列和尾部序列的突變會影響RNA的轉錄和復制，兩端的非編碼區在病毒的轉錄和復制中起著關鍵性作用。研究人員構建副粘病毒基因組全長cDNA克隆時，為避免外來核苷酸在體外轉錄過程中插入RNA模板的5’端和3’端，會在兩端引入具有自我剪切功能的核酶序列。比如在病毒序列5’端和3’端分別引入丁肝核酶(HDVRZ)和錘頭狀核酶(HHRZ)，兩種核酶轉錄完成后，可分別在5’首端堿基之前和3’末端堿基之后發生特異性剪切，從而得到完整且準確的基因組末端序列[25-26]，此方法在拯救負鏈RNA病毒中應用較為廣泛。

T7 RNA聚合酶是一種依賴DNA的RNA聚合酶，其對噬菌體T7啟動子序列具有高特異性，能夠特異性地轉錄位于T7啟動子下游的的DNA。在副黏病毒的反向遺傳學研究中，通常在病毒基因組cDNA的5’端插入T7啟動子，這就要求宿主細胞提供T7 RNA聚合酶以配合轉染質粒在細胞內轉錄。因此需要篩選出能穩定表達T7 RNA聚合酶的特定細胞系，或者利用重組的T7 RNA聚合酶痘苗病毒提前感染宿主細胞獲得外源性T7 RNA聚合酶。以上策略操作復雜且轉染細胞易受干擾，尤其對拯救具有嚴格細胞適應性的病毒而言影響更大。

為了解決上述問題，研究人員開發了一個基于人巨細胞病毒(CMV)啟動子的系統，即在病毒基因組cDNA的5’端插入CMV啟動子代替T7啟動子，利用真核細胞自身表達的RNA聚合酶II直接識別CMV啟動子。CMV系統的優點是避免產生由于引入外源性T7 RNA聚合酶而引起宿主細胞發生CPE，或由于增加了共轉染質粒的數量而降低系統性能的問題。由于RNA聚合酶II位于細胞核的核質內，最初認為驅動CMV啟動子的RNA聚合酶II系統用于拯救核復制病毒效果會更好。而后研究表明CMV系統也可用于拯救其他非核復制病毒，如2011年Li等人將NDV的I系苗Mukteswar毒株全長序列分別置于T7啟動子和CMV啟動子后，都獲得了具有感染性的病毒粒子，并且采用CMV啟動子拯救系統的拯救效率顯著高于前者[27]。至于采用T7啟動子還是CMV啟動子主要取決于實驗室現有的條件，目前市場已有成熟穩定表達T7 RNA聚合酶的細胞系，在極大提高病毒拯救效率的同時也避免了由于引入外源T7 RNA聚合酶輔助拯救病毒而引起的CPE的難題。

4.2 參考NDV的拯救策略在傳統的副粘病毒反向遺傳學研究中，病毒拯救依賴于將含有病毒基因組全長序列的質粒分別與三個含有N、P和L基因獨立克隆的輔助質粒共轉染真核細胞。

下面將從副粘病毒科NDV反向遺傳學最新研究進展中分析可能用于拯救PPRV的策略，有望促進PPRV反向遺傳技術的發展。2008年Gao等人[28]在基于RNA聚合酶I系統之上，將NDV弱毒株B1株三個外部基因和三個內部基因克隆到帶有T7啟動子的轉錄載體上，然后將兩個含有全長序列的轉錄載體和三個輔助質粒共轉染細胞，拯救出的重組NDV生長特性與親本毒一致。副粘病毒基因組大小為15～16kb，構建全長cDNA克隆時容易發生突變，如果能將全長基因組分節段克隆到兩個質粒進行轉錄將提高病毒拯救效率。Gao等人[28]的研究為PPRV拯救提供了一條新思路。2020年Wang N等人[29]建立了一種簡單可靠的NDV反向遺傳操作系統，研究構建的一個NDV基因組全長質粒采用T7啟動子驅動，其他三個輔助質粒系統采用CMV啟動子驅動，同時構建了一個不使用輔助病毒就能夠增強表達T7 RNA聚合酶的質粒，通過五個質粒共轉染成功拯救出重組NDV病毒。

2017年Liu等人[30]開展了雙質粒拯救系統的研究，雙質粒系統是一種新方法，其創新點在于構建了一個輔助質粒，其中包含了可編碼三個病毒復制所需蛋白(N、P和L)的翻譯盒，每個翻譯盒都有一個合適的啟動子(T7或CMV)和終止子(T7T或Poly-A tail)，根據拯救策略的不同，可選擇性地使用或不使用外源性T7 RNA聚合酶。另外，研究人員還構建了病毒全長反基因組的質粒，將其與輔助質粒共轉染到細胞中，拯救出感染性病毒。與傳統的四質粒系統相比，雙質粒系統具有更高的拯救效率，并且適用于四質粒系統無法拯救的病毒[30-31]。

除了以上多質粒拯救系統外，還有基于單質粒的拯救系統。單股負鏈RNA病毒的反向遺傳操作系統的建立依賴于含有病毒基因組全長cDNA的質粒和含有病毒復制相關基因的輔助質粒進行共轉染。Peeters B[32]提出了一種新的拯救策略，即利用單個質粒拯救NDV，無需使用輔助質粒。這種方法是將T7或CMV啟動子序列插入或替換病毒復制基因的亞基因組RNA的非編碼區，位置的選擇應確保編碼病毒復制必要蛋白的亞基因組RNA轉錄，從而形成RNPs復合物，同時還要避免干擾病毒基因組中增強下游基因表達的基本元件。由于病毒復制策略的相似性，單質粒系統理論上也可適用于大多數非節段負鏈RNA病毒。

目前，對已經拯救出的PPRV反向遺傳系統進行分析，科研人員均采用四質粒拯救體系，其中Hu等人采用CMV啟動子對病毒進行拯救，直接將質粒轉染到PPRV易感細胞中，完成病毒組裝釋放；而Muniraju M和Liu F等人則采用T7啟動子對病毒進行拯救，將質粒轉染到改造過帶有T7聚合酶的真核細胞系中，完成病毒的組裝。PPRV反向遺傳技術的應用大多集中在將一段外源基因插入PPRV基因組中，做成基因聯苗。由于PPRV反向遺傳操作系統尚不成熟，病毒拯救困難。因此，建立穩定可靠的PPRV反向遺傳操作系統對研究其致病機制十分重要。

5 展望