川續斷皂苷乙對氟苯尼考在大鼠體內的藥動學影響

王 斌，李思聰，梁 歌，李金良，張 敏，袁定勝，李旭廷

(動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川省畜牧科學研究院，成都 610066)

氟苯尼考(Florfenicol，FFC)是畜禽專用的新型廣譜抗菌藥，本品通過抑制肽酰基轉移酶活性而產生廣譜抑菌作用，抗菌譜廣，包括各種革蘭氏陽性、陰性菌和支原體等[1]。本品口服吸收迅速，分布廣泛，半衰期長，血藥濃度高，血藥維持時間長，在畜禽和水產動物的細菌性疾病防治中應用廣泛[2]。川續斷皂苷乙是一種重要的五環三萜齊墩果烷類皂苷化合物，具有很好的心血管保護、抗氧化、保肝、抗炎、抗腫瘤及免疫調節和抗骨質疏松等多種生物活性[3-4]，已從忍冬屬植物山銀花、灰氈毛忍冬、華南忍冬、水銀花等發現該化合物的存在[5-6]。課題組開展了芍藥苷、白頭翁皂苷、甘草、黃芩苷等中獸藥制劑及單體成分對氟苯尼考代謝的影響研究[7-9]，本文開展川續斷皂苷乙在大鼠體內對氟苯尼考代謝的影響研究，進一步在基因和蛋白水平進行確證，探討可能發生的藥動學相互作用及其機制，從藥物代謝酶角度為川續斷皂苷乙的配伍規律提供實驗依據，也為推動中西結合藥動學發展提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 健康清潔級SD雄性大鼠，體重(200±20) g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(川)2013-24。整個試驗期間，于室溫20～24 ℃下飼養，每天供給試驗用SD大鼠專用飼料及純化水，采血前12 h限飼。

1.1.2 主要試驗儀器 UltiMate3000高效液相色譜儀，美國戴安公司產品；ZGDCY-48S水浴氮吹儀，上海梓桂儀器有限公司產品；CQ250超聲洗滌器，上海超聲儀器廠產品；800B臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產品；WH-3微型旋渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠產品；MiniSpin Plus 個人型高速離心機，德國艾本德公司產品；StepOne型熒光定量PCR儀，美國應用生物系統公司產品。

1.1.3 藥品與試劑 川續斷皂苷乙(CAS Number：33289-85-9，含量99.82%)，中國食品藥品檢定研究院；氟苯尼考對照品(編號K0301703，含量為99.1%)，中國獸醫藥品監察所產品；氯霉素標準品(批號130555-201704)，中國藥品生物制品檢定所產品；氟苯尼考原料藥(批號202012125，純度為98.9%)，浙江康牧藥業有限公司產品；甲醇、乙腈(色譜純)，艾萬拓化工產品貿易(上海)有限公司產品；乙酸乙酯等其余試劑均為分析純，成都科龍化工試劑廠產品。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方法 24只健康大鼠隨機分為2組，每組12只。試驗組連續7 d每天灌服川續斷皂苷乙，根據《中國藥典》2015年版山銀花人的臨床劑量,計算實驗大鼠臨床劑量約為1. 35 g/kg，根據藥典規定山銀花中川續斷皂苷乙的含量5%計算試驗大鼠川續斷皂苷乙的用量約為60 mg/kg, 1 次/d，空白組則給予相應體積的生理鹽水，禁食12 h后于第8天，氟苯尼考按劑量30 mg/kg(氟苯尼考原粉溶于10%PEG-400配制成1%溶液)分別灌服2個組的各6只大鼠，并于給藥后0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h斷尾采集血液約0.1 mL，EDTA抗凝，4000 r/min離心5 min，分離血漿，置-20 ℃冰箱中保存待用。兩個組剩余各6只大鼠于第8天乙醚麻醉后放血處死，分離肝臟和空腸組織用冰生理鹽水漂洗濾干后凍存。

1.2.2 樣品的處理 精確取血漿0.1 mL于試管中，加入10 μL氯霉素內標液(500 μg/mL)和400 μL乙酸乙酯，渦動混合2 min，4000 r/min離心10 min，吸取上層液于另一離心管中，然后再加入乙酸乙酯400 μL重復提取1次，合并兩次提取液。在40 ℃水浴中氮氣吹干，殘渣加入200 μL流動相溶解，渦動混合2 min，12000 r/min離心10 min，將上清液轉移至進樣瓶，取20 μL進樣檢測。

1.2.3 標準曲線的制備 取空白血漿180 μL，加入20 μL氟苯尼考系列標準溶液，配制成50、20、10、5.0、2.5、0.5、0.1、0.05 μg/mL系列標準血漿樣品，按1.2.2項下方法處理樣品，以氟苯尼考與氯霉素峰面積的比值對相應氟苯尼考濃度作線性回歸，求回歸方程和相關系數。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：Agilen HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(27∶73，V/V)；流速1.0 mL/min；檢測波長223 nm；柱溫40 ℃；進樣量20 μL。

1.2.5 分析方法質量控制 以血漿樣品高、中、低(0. 1、2. 5、20 μg/mL)3個濃度氟苯尼考考察方法的提取回收率和精密度，每個樣品做5個重復。

1.2.6 RT-PCR檢測大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1 mRNA表達量 取100 mg組織用組織破碎儀進行破碎，按照說明書用Trizol法提取組織總RNA。測定樣品OD260 nm/OD280 nm比值，確定RNA濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。用反轉錄試劑盒將RNA反轉成cDNA，利用premier5.0軟件設計大鼠CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和看家基因β-actin引物序列(由上海生工生物公司合成)。實時熒光定量PCR檢測上述基因mRNA轉錄水平，PCR反應體系20 μL：cDNA 模板2 μL；上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL；SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL；ddH2O 7.2 μL。反應程序如下：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，55～61 ℃退火15 s；72 ℃延伸20 s，共45個循環；60 ℃延伸1 min。結果采用相對定量分析，用ΔCt法計算基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.7 大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1和P-糖蛋白表達的測定 稱取0.1 g 肝臟組織，加入1 mL組織蛋白抽提試劑，研磨后冰上孵育20 min，于10000×g 離心15 min 提取蛋白，用BCA 法測定蛋白含量。每組蛋白上樣量為50 μg，120 V 恒壓電泳90 min。采用半干電轉，450 mA，100 min。用含5%脫脂奶粉和1%BSA的TBST封閉液，4 ℃封閉過夜，加入稀釋后的CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1和P-糖蛋白一抗及GADPH 抗體(1∶500)，4 ℃過夜，用TBST 在室溫下脫色搖床洗3 次。洗膜后加入量稀釋的二抗(1∶10000)，于室溫孵育50 min，用TBST 室溫脫色搖床洗3 次，進行化學發光反應。

2 結果與分析

2.1 線性結果 以氟苯尼考與氯霉素峰面積的比值對相應氟苯尼考濃度作線性回歸，得出氟苯尼考在質量濃度為0.05～50 μg/mL的范圍內線性關系良好，回歸方程為y=0.0309x+0.0078，相關系數R2=0.999。標準曲線見圖1。

圖1 血漿藥物濃度標準曲線

2.2 方法回收率和精密度 測得方法回收率分別為(83.2±1.6)%、(84.1±2.3)%和(83.5±2.2)%，測得日內RSD分別為4.6%、2.3%和6.1%，測定日間RSD分別為4.5%、2.1%和6.2%。按信噪比S/N=3計算，最低檢測限為0.02 μg/mL。

2.3 藥動學參數 試驗組和對照組大鼠均按單劑量(30 mg/kg)給予氟苯尼考后，測定不同時間點的氟苯尼考血藥濃度，其血藥濃度-時間曲線見圖2所示，藥動學參數見表2，結果表明，試驗組AUC(0-∞)為34.468±3.346 mg/L·h，與對照組25.764±3.967 mg/L·h相比顯著增加(P<0.05)，平均駐留時間MRT0-∞為4.308±1.206 h，與對照組3.019±0.550相比顯著增加(P<0.05)；半衰期T1/2為3.208±0.860 h，與對照組1.824±0.266 h相比顯著增加(P<0.05)，達峰濃度(Cmax)為10.144±1.538 mg/L，與對照組7.358±1.158 mg/L相比顯著增加(P<0.05)，對照組清除率CL為0.759±0.192 L/h·kg，與對照組1.190±0.199 L/h·kg相比顯著降低(P<0.05)。達峰時間Tmax和表觀分布容積(Vd)，試驗組和對照組之間差異不顯著。

圖2 試驗組和對照組在大鼠體內的氟苯尼考(30 mg/kg)的血藥濃度-時間曲線

表2 試驗組和對照組在大鼠體內的氟苯尼考(30 mg/kg)藥動學參數

2.4 川續斷皂苷乙對大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和空腸CYP3A1、MDR1 的mRNA表達影響 如圖3(A)可知，試驗組肝臟CYP1A2和CYP2C11 mRNA表達水平與對照組相比，分別降低68.8%和55.0%(P<0.05)，CYP3A1和MDR1 與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。由圖3(B)可知，試驗組空腸MDR1 mRNA表達水平與對照組相比，降低43.2%(P<0.05)，CYP3A1與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖3 大鼠口服川續斷皂苷乙對肝臟(A)中CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和空腸(B)中CYP3A1、MDR1 mRNA表達的影響 (n=6)

2.5 川續斷皂苷乙對大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、P-gp和空腸CYP3A1、P-gp蛋白表達的影響 由圖4(A)和圖4(B)可知，試驗組肝臟中CYP1A2和CYP2C11蛋白表達量與對照組相比分別降低38.71%和26.64%(P<0. 05)，CYP3A1、P-gp差異不顯著；由圖5(A)和圖5(B)可知，空腸中P-gp表達量與對照組相比下降50.93%(P<0.05)，CYP3A1也降低，但差異不顯著(P>0.05)。

圖4 川續斷皂苷乙對肝臟中CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、P-gp蛋白表達的影響 (n=6)

圖5 大鼠口服川續斷皂苷乙對空腸中CYP3A1和P-gp蛋白表達的影響 (n=6)

3 討 論

藥物的相互作用(drug-drug interaction, DDI)指在一定時間內先后服用兩種或兩種以上藥物后所產生的復合效應，其中，代謝性藥物的藥物相互作用發生率最高，約占藥代動力學相互作用的40%，可引起療效增強甚至產生不良反應，或療效減弱甚至治療失敗[10]。本試驗采用川續斷皂苷乙(60 mg/kg)連續大鼠灌胃7 d，給予氟苯尼考，試驗組的聯用后Cmax值與對照組相比顯著增加(P<0.05)，Tmax與對照組之間差異不顯著，表明川續斷皂苷乙增加了氟苯尼考在大鼠體內的吸收程度，但對吸收速度無明顯影響。同時，藥物代謝過程中也發生了相互作用，川續斷皂苷乙與氟苯尼考聯用后，MRT0-∞和T1/2與對照組相比顯著增加，CL與對照組相比顯著降低(P<0.05)，表明川續斷皂苷乙延緩了氟苯尼考在大鼠體內的代謝速度，降低了氟苯尼考的清除速率，AUC0-∞顯著增加，是由于氟苯尼考的吸收程度增加，代謝減慢共同導致。

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和細胞色素P450酶系介導的藥物相互作用，是中西藥聯用發生藥動學相互作用最主要的因素，也是最常見的原因。P-糖蛋白可把其底物藥物從腸上皮細胞主動轉運回腸腔，使藥物吸收減少，生物利用度降低[11]。細胞色素P450酶系受到誘導或抑制，會影響藥物在動物體內的代謝，造成藥效學的改變[10]。川續斷皂苷乙是一種重要的五環三萜齊墩果烷類皂苷化合物，已有研究表明，類似三萜結構的中藥單體對人和動物的藥物代謝酶和轉運酶有不同程度的影響。如薩礎拉等[12]采用大鼠外翻腸囊模型研究了三七皂苷有效組分中人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1，發現其具有明顯的P-gp底物轉運特性并可競爭性抑制P-gp底物外排。Liu R[13]等研究發現，三七總皂苷可下調CYP1A2蛋白的表達，柴胡皂苷處理后的肝細胞，能夠明顯誘導CYP1A2的mRNA表達和增強CYP1A2的活性[14]，人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1可以誘導CYP1A1 mRNA與蛋白水平的表達[15]。本研究中發現，川續斷皂苷乙連續大鼠灌胃7 d，可抑制空腸中MDR1的mRNA表達量和P-糖蛋白的表達量，這可能是造成氟苯尼考藥動學參數Cmax增加，引起氟苯尼考在腸道內的吸收程度增大的主要原因。同時，肝臟中CYP1A2和CYP2C11的mRNA表達水平(P<0.05)和相應的蛋白表達水平降低，可能是造成了氟苯尼考在大鼠體內的代謝減慢，引起藥動學參數MRT0-∞和T1/2增加的主要原因。

綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙是山銀花的主要成分，綠原酸對CYP450酶活性和P-gp活性影響的研究已有報道[16-17]，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙對CYP450酶及P-gp活性影響未見研究報道。山銀花和金銀花俗稱銀花，生產實踐中兩者常常并用、混用，很多獸用成方制劑，如銀黃口服液、雙黃連口服液、銀翹散等，都含有銀花成分，在獸醫臨床上配合氟苯尼考等抗菌藥物治療畜禽感染性疾病，取得較好的治療效果。本試驗開展川續斷皂苷乙對氟苯尼考代謝的影響研究，對拓展川續斷皂苷乙及山銀花在畜牧健康養殖中應用具有現實意義。

綜上所述，川續斷皂苷乙連續灌胃一周對氟苯尼考在大鼠體內的吸收和代謝有一定的影響，加快了氟苯尼考在大鼠體內的吸收程度和減緩了代謝，提示臨床上兩者合用有潛在增效作用，但獸醫臨床兩者藥物同時使用的藥效學結果有待進一步加以確證。氟苯尼考藥代學的改變可能與川續斷皂苷乙抑制了大鼠肝臟中CYP1A2和CYP2C11的表達以及空腸中P-gp的表達有關。本研究為川續斷皂苷乙的臨床應用及川產道地藥材山銀花的進一步開發提供了基礎研究數據。