基于數(shù)據(jù)挖掘探討中藥治療卵泡發(fā)育不良用藥規(guī)律及實驗驗證

趙秀萍 馬小娜 張秀平 陳妮妮 朱秀娟

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科，北京，100029；2 浙江藥科職業(yè)大學(xué)中藥學(xué)院，寧波，315500)

卵泡發(fā)育不良(Follicular Dysplasia)是指卵泡的大小、數(shù)量、形態(tài)及生長速度異常而導(dǎo)致月經(jīng)失調(diào)、自然流產(chǎn)或不孕癥的一類疾病，超聲監(jiān)測下表現(xiàn)為卵泡發(fā)育停滯、卵泡閉鎖、小卵泡排卵等形式[1]。在《女性生殖道病理學(xué)》[2]中指出卵泡發(fā)育不良從病理學(xué)角度為顆粒細(xì)胞增殖紊亂、沒有卵泡腔的卵泡,或大小正常卻含有大量考爾-埃克斯納小體的卵泡。研究發(fā)現(xiàn)卵泡發(fā)育不良在不孕癥和自然流產(chǎn)患者中的發(fā)病率差異較大，為27%～86.17%不等[3-4]。其反復(fù)發(fā)作且逐漸增高的發(fā)病率嚴(yán)重影響了育齡期女性的身心健康。

中醫(yī)無“卵泡發(fā)育不良”病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸屬于“月經(jīng)病”“滑胎”“不孕癥”等范疇。近年來，中醫(yī)藥運(yùn)用辨證論治及整體觀念，因人制宜，在治療卵泡發(fā)育不良過程中發(fā)揮了較顯著的優(yōu)勢，其不良反應(yīng)小，接受度高，一定程度上彌補(bǔ)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療該病的不足。但目前關(guān)于卵泡發(fā)育不良中醫(yī)病因病機(jī)、辨證、治法尚無統(tǒng)一論述，多為臨床經(jīng)驗用藥。本研究收集近20年中醫(yī)藥治療卵泡發(fā)育不良文獻(xiàn)，借助數(shù)據(jù)挖掘分析近年來中醫(yī)藥治療卵泡發(fā)育不良的用藥特點及配伍規(guī)律，并通過動物實驗探究聚類分析獲得中藥新方對排卵障礙大鼠卵巢功能的影響，從而為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索 檢索2002年1月至2022年1月由國家知識基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(China Biology Medicine Database，CBM)、中國學(xué)術(shù)期刊數(shù)據(jù)庫(China Science Periodical Database，CSPD)及中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(Chinese Citation Database，CCD)、PubMed數(shù)據(jù)庫中收錄的全部中英文文獻(xiàn)，并刪除重復(fù)文獻(xiàn)。本文以“卵泡發(fā)育不良(Follicular Dysplasia)”“小卵泡排卵(Small Follicle Ovulation)”“排卵障礙(Ovulatory Dysfunction)”“中藥(Traditional Chinese Medicine)”“中西醫(yī)(Traditional Chinese and Western medicine)”等為主題詞。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 采用有明確藥物組成的中藥復(fù)方或中成藥組方治療卵泡發(fā)育不良的臨床隨機(jī)對照試驗。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)臨床經(jīng)驗及理論類文獻(xiàn)；2)動物及細(xì)胞實驗研究；3)外敷、灌腸、等外用藥物或針灸類臨床研究；4)單味藥及藥物信息不全、療效不確切的研究。

1.4 藥物規(guī)范化及統(tǒng)計 將納入文獻(xiàn)的方劑錄入Excel2019，提取中藥名稱，根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》[5]和《中藥大辭典(上冊)》[6]查詢性、味、歸經(jīng)，對中藥名稱規(guī)范化處理：1)如桑葚→桑椹、仙靈脾→淫羊藿，炒當(dāng)歸→當(dāng)歸。2)有加減方藥則只統(tǒng)計基本方。3)有重復(fù)名稱或重復(fù)藥物組成方劑則只統(tǒng)計1次。

1.5 聚類分析統(tǒng)計 數(shù)據(jù)由雙人錄入校對，進(jìn)行二分類量化，方劑中出現(xiàn)該藥物記錄為“1”，未出現(xiàn)錄為“0”，系統(tǒng)聚類分析設(shè)置最小聚類數(shù)5，最大聚類數(shù)為10，采用組間連接，以Pearson相關(guān)性分析，以樹狀圖展示，得出新的用藥配伍。

將高頻藥物量化處理，采用SPSS Modeler 18.0軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析及網(wǎng)絡(luò)展示，圖中線條越粗、顏色越重表示藥物之間的關(guān)聯(lián)度越強(qiáng)。再通過建模中關(guān)聯(lián)的Apriori算法挖掘藥物之間的配伍關(guān)系，設(shè)置最低支持度為25%，最小置信度為85%，最大前項數(shù)為3，提升度>1。

經(jīng)2名副高以上婦科專家對以上聚類組方進(jìn)行探討，最后選用第三類組方(以下稱補(bǔ)腎健脾方)作為動物實驗用方。

1.6 補(bǔ)腎健脾方實驗與方法

1.6.1 實驗動物 選取鼠齡10 d左右SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量(40±5)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[合格證編號SCXK(京)2016-0006]。所有大鼠均飼養(yǎng)在動物房內(nèi)，保持室內(nèi)溫度恒定25 ℃，光照12 h明暗交替循環(huán)。所有大鼠均自由進(jìn)食攝水，適應(yīng)新環(huán)境5 d后進(jìn)行后續(xù)實驗。動物倫理審批由中日友好醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會審批(倫理審批號:zryhyy21-20-12-1)

1.6.2 藥物及試劑 實驗中藥購自北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中藥房，按臨床常規(guī)用藥劑量使用，第1次加6倍量水浸泡60 min，煎煮30 min，第2次加4倍量水煎煮30 min，合并2次煎出液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，換算成適合濃度以1 mL/100 g灌胃。來曲唑片(2.5 mg/片,江蘇芙瑞制藥公司,生產(chǎn)批號：210701)、丙酸睪酮注射液(1 mL：25 mg/支，天津金耀氨基酸有限公司，批號：1810231)；雌二醇(Estradiol,E2)試劑盒(貨號：AB-J0001B)、促黃體素(Lutropin，LH)劑盒(貨號：AB-6623B)、促卵泡素(Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH)試劑盒(貨號：AB-J0015A)、孕激素(Progestogen，P)試劑盒(貨號：AB-2092A)，以上均購自艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司。

1.6.3 造模分組及給藥 將大鼠逐一編號，通過隨機(jī)數(shù)字表抽取，按數(shù)字大小排序，每10個數(shù)對應(yīng)的大鼠為一組，選取其中一組10只大鼠作為空白對照組，在頸背部皮下注射等量生理鹽水；其余30只大鼠參照文獻(xiàn)[7]研究方法將大鼠頸背部皮下注射丙酸睪丸酮1.25 mg/只(0.05 mL/只)。從第70日齡開始每天檢查陰道脫落細(xì)胞涂片，連續(xù)10 d(2個性周期)，如陰道上皮無周期變化，細(xì)胞呈持續(xù)角化狀態(tài)，則判斷造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、來曲唑組、補(bǔ)腎健脾方組，每組10只。各組大鼠分籠飼養(yǎng),在不施加處理時均自由飲水及每天給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。來曲唑組：以5 mL含來曲唑7 mg/kg的生理鹽水灌胃，連續(xù)3 d停藥。補(bǔ)腎健脾方組：將新煮中藥方以25 g/(kg·d)以1 mL/100 g灌胃，連續(xù)5周。對照組及模型組以相同體積蒸餾水灌胃，連續(xù)5周。

1.6.4 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 給藥結(jié)束后，各組大鼠禁食12 h進(jìn)行腹主動脈取血，備用，后經(jīng)麻醉后處死，取兩側(cè)卵巢組織固定于4%甲醛溶液中，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋切片后染色，組織切片厚度為4 μm，光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢最大切面中各級發(fā)育卵泡、黃體數(shù)目情況。

1.6.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠血清性激素水平 取腹主動脈血5～6 mL，離心分離，取上層血清置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫疵嘎?lián)免疫吸附試驗試劑盒要求步驟操作進(jìn)行FSH、LH、E2、P水平檢測。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘

2.1.1 高頻藥物使用情況 本研究共納入136篇文獻(xiàn)，刪除重復(fù)方劑，涉及132張?zhí)幏剑灿?46味中藥，總頻次1 570次。用藥頻次≥20次的藥物共27味，其中當(dāng)歸、菟絲子用藥頻次最高為98次，用藥頻率(單味藥用藥次數(shù)/處方數(shù))為67.1%，其次為熟地黃92次，用藥頻率63%，枸杞子60次，用藥頻率41.1%，山藥57次，用藥頻率39%。見表1。

2.1.2 證型分類 共納入125篇記錄了證型的文獻(xiàn)，剔除6篇無對應(yīng)病例數(shù)，涉及3 986例患者，共得到8種證型，主要包括腎虛血瘀證、腎陰虛證、腎陽虛證、腎虛肝郁證、腎氣虧虛證。見表2。

表2 卵泡發(fā)育不良的證型分類

2.1.3 藥物分類頻數(shù)分析 將146味中藥進(jìn)行功能分類，主要有活血化瘀藥、補(bǔ)陰藥、補(bǔ)陽藥、清熱藥、理氣藥等17類，其中補(bǔ)益藥用藥頻率最高，共45次(補(bǔ)陰藥15次、補(bǔ)陽藥14次、補(bǔ)氣藥11次、補(bǔ)血藥5次)、活血化瘀藥用藥頻次為24次，其次為清熱藥、理氣藥、解表藥。見表3。

表3 藥物使用類別及頻次

2.1.4 藥物性、味、歸經(jīng)頻數(shù)分析 將藥物進(jìn)行性、味、歸經(jīng)頻次分析，其中藥味使用頻次最高者為甘味，共81次，其次為辛味、苦味，頻次分別為53次、52次。見圖1A；藥性使用頻次最高者為溫性藥，共48次，其次為平性，37次。見圖1B；歸經(jīng)頻數(shù)最高為腎經(jīng)，共81次，其次為脾經(jīng)、肝經(jīng)、心經(jīng)，頻次分別為71次、56次、47次。見圖1C。

圖1 藥物性、味、歸經(jīng)頻次雷達(dá)圖

2.1.5 高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 可見當(dāng)歸、菟絲子、熟地黃關(guān)聯(lián)最密切。見圖2。共挖掘核心藥對14組，按支持度排序可見當(dāng)歸、熟地黃-菟絲子為核心藥對，其次為熟地黃、枸杞子-當(dāng)歸。見表4。

表4 高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

圖2 高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

2.1.6 高頻藥物聚類分析及選方 將高頻藥物聚類分析得到三類新方組合。類1包含山藥、山茱萸、熟地黃、杜仲、續(xù)斷、鹿角膠，以補(bǔ)腎藥物為主。類2包含枸杞子、女貞子、雞血藤、牛膝、白芍、柴胡、茯苓、當(dāng)歸、川芎、制香附、丹參、甘草，以補(bǔ)腎、疏肝、活血藥物為主；類3包含白術(shù)、黨參、黃芪、菟絲子、覆盆子、巴戟天、肉蓯蓉、淫羊藿，以補(bǔ)腎、健脾、益氣藥物為主。見圖3。經(jīng)專家判定最后選用第三類組方(簡稱補(bǔ)腎健脾方)作為動物實驗中藥組用藥，方藥組成：白術(shù)15 g、黨參30 g、黃芪30 g、菟絲子15 g、覆盆子10 g、巴戟天10 g、肉蓯蓉10 g、淫羊藿10 g。

圖3 高頻藥物聚類分析樹狀圖

2.2 補(bǔ)腎健脾方對排卵障礙大鼠卵巢功能的影響

2.2.1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)比較 對照組卵巢組織中可見各級卵泡發(fā)育，發(fā)育卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞層數(shù)增多，排列密集，并可見多個黃體；模型組大多卵泡呈囊性擴(kuò)張，形狀不規(guī)則，顆粒細(xì)胞幾乎消失，黃體少見；與模型組比較,來曲唑組及補(bǔ)腎健脾方組卵巢內(nèi)卵泡囊性擴(kuò)張明顯減少，發(fā)育卵泡增多，顆粒細(xì)胞層次增加，且均有少許黃體生成，但來曲唑組卵泡數(shù)目多于補(bǔ)腎健脾方組。見圖4。

圖4 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)比較(HE染色，×40)

2.2.2 各組大鼠血清性激素比較 與對照組比較，模型組大鼠血清中E2、P、FSH水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，來曲唑組及補(bǔ)腎健脾方組E2、P及FSH水平有所升高，但各組LH水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠FSH、LH、E2測定

3 討論

3.1 證型及藥物分析 卵泡發(fā)育不良被視為不孕癥、自然流產(chǎn)的“未病”階段[8]，臨床中易周期性重復(fù)發(fā)生。西醫(yī)主要采用促排卵藥物治療，但易出現(xiàn)子宮內(nèi)膜生長與卵泡發(fā)育不同步、卵巢過度刺激綜合征、卵巢低反應(yīng)，黃素化未破裂綜合征等并發(fā)癥[9]。近年來，中醫(yī)藥在促進(jìn)卵泡發(fā)育、改善排卵障礙、改善女性生殖功能等方面取得了較好的臨床效果[10]。卵泡秉承女子先天生殖之精而生，其發(fā)育、成熟及排出均有賴于腎精、腎氣的充盈。若腎精不足，胞宮失于濡養(yǎng)，則卵泡生長延遲或閉鎖；若腎陽虧虛，動力不足，則卵泡排出障礙，由此可見，卵泡發(fā)育不良、排卵障礙根本之病因病機(jī)即腎虛[11]。本研究根據(jù)納入有證型文獻(xiàn)，歸納涉及8種證型，主要包括腎虛血瘀證、腎陰虛證、腎陽虛證、腎虛肝郁證及腎氣虧虛證等。研究結(jié)果顯示使用頻次≥20次的有當(dāng)歸、菟絲子、熟地黃、枸杞子、山藥、山茱萸、淫羊藿等27味中藥，藥性以溫、平為主，微寒次之，藥味以甘為主、辛、味次之。甘味藥可補(bǔ)益五臟氣、血、陰、陽之不足，多見于補(bǔ)益類藥物，辛味藥具有發(fā)散、行氣、行血之功，多見于理氣藥及活血藥。歸經(jīng)以腎、脾、肝為主，中醫(yī)理論認(rèn)為腎藏精，主命門真火，為先天之本，而脾主運(yùn)化水谷精微，化生氣血，為后天之本，2種相互資生，正如《醫(yī)門棒喝》指出“脾胃之能生化者，實由腎中元陽之鼓舞，而元陽以固密為貴，其所以能固密者，又賴脾胃生化陰精以涵育耳”。

3.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則及新方組合 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析中，結(jié)合藥對的支持度及置信度顯示治療卵泡發(fā)育不良的核心藥對為當(dāng)歸、熟地黃-菟絲子。藥對中當(dāng)歸味甘、辛、性溫，可補(bǔ)血、行血，補(bǔ)中有動，行中有補(bǔ)，為血中之要藥。熟地黃味甘，性微溫，可補(bǔ)血滋潤、益精填髓。在古籍《綱目》記載熟地黃可“填骨髓，長肌肉，生精血，補(bǔ)五臟、內(nèi)傷不足，通血脈，利耳目，黑須發(fā)，男子五勞七傷，女子傷中胞漏，經(jīng)候不調(diào)，胎產(chǎn)百病”。菟絲子味甘辛，性平，入肝、腎經(jīng)，可補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目、安胎，三藥共奏滋補(bǔ)肝腎，活血通絡(luò)之功。臨床中該藥對存在于較多的中藥處方中，用于治療卵泡發(fā)育異常疾病。實驗研究發(fā)現(xiàn)右歸丸可增加大鼠卵巢血管數(shù)目，維持卵泡生長，減少卵泡閉鎖，并通過下調(diào)C-X-C基序配體8(C-X-C Motif Ligand 8，CXCL8)/C-X-C趨化因子受體(C-X-C Chemokine Receptor，CXCR)1/2通路促進(jìn)大鼠卵巢組織中血管的生成，從而改善卵巢功能[12]。毓麟珠可明顯改善早發(fā)性卵巢功能不全患者的臨床癥狀，降低FSH、LH并提高E2水平，并能增加卵巢基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)及子宮內(nèi)膜厚度[13]。歸芍地黃湯加減聯(lián)合溫針灸治療卵泡發(fā)育不良不孕患者的療效更為顯著，能夠改善卵泡發(fā)育情況及排卵結(jié)局，進(jìn)而減輕臨床癥狀，促進(jìn)女性生殖軸平衡協(xié)調(diào)[14]。

聚類分析得到三類治療卵泡發(fā)育不良的新方組合，類1包含山藥、山茱萸、熟地黃、杜仲、續(xù)斷、鹿角膠，以補(bǔ)腎陰為主，更加鹿角膠以溫補(bǔ)腎陽，使得陰陽雙補(bǔ)，用于治療腎虛型卵泡發(fā)育不良患者。類2包含枸杞子、女貞子、雞血藤、牛膝、白芍、柴胡、茯苓、當(dāng)歸、川芎、制香附、丹參、甘草。其中枸杞子、女貞子可滋補(bǔ)肝腎，雞血藤、牛膝、丹參又可活血調(diào)經(jīng)，柴胡、制香附可疏肝理氣，甘草調(diào)和諸藥，全方共奏補(bǔ)腎活血，兼以疏肝理氣之功，可用于腎虛血瘀兼有氣滯型的卵泡發(fā)育不良。類3包含白術(shù)、黨參、黃芪、菟絲子、覆盆子、巴戟天、肉蓯蓉、淫羊藿，以補(bǔ)腎健脾益氣為主，方中在補(bǔ)腎藥物基礎(chǔ)上加黨參、黃芪、白術(shù)等益氣健脾等藥物，先后天之本相互資生，使得脾氣得以腎陽的溫煦，腎中精氣又賴脾運(yùn)化的水谷精微不斷補(bǔ)充，用于治療脾腎不足卵泡發(fā)育不良。以上聚類分析進(jìn)一步證實了卵泡發(fā)育不良與腎虛密切相關(guān)，臨床施治時需要謹(jǐn)記兼顧健脾、活血、疏肝之法，不忘補(bǔ)腎的理念，因人而異，辨證選擇不同的藥物配伍。全方綜合補(bǔ)腎健脾益氣之功，取先后天之本相互資生之意。

3.3 補(bǔ)腎健脾方對排卵障礙大鼠的影響 本實驗制備雄激素所致排卵障礙大鼠模型，運(yùn)用聚類新方補(bǔ)腎健脾方干預(yù)排卵障礙大鼠，并將來曲唑作為陽性對照組，進(jìn)而觀察挖掘新方補(bǔ)腎健脾方對排卵障礙大鼠卵泡形態(tài)及性激素的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠卵巢內(nèi)卵泡多呈囊性擴(kuò)張，顆粒細(xì)胞減少或消失，無黃體生成，而經(jīng)補(bǔ)腎健脾中藥干預(yù)后，卵泡發(fā)育及黃體數(shù)目與模型組比較均明顯改善，且顆粒細(xì)胞與模型組比較數(shù)目增多，排列緊密。補(bǔ)腎健脾方組血清FSH、E2及血清P水平均與模型組比較明顯升高。FSH作為促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟過程的一種促性腺激素[15],可以誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞芳香化酶的活性,提高顆粒層細(xì)胞的雌激素含量，進(jìn)一步促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟[16]。垂體脈沖式分泌LH可促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞合成雄激素,在竇前卵泡中發(fā)揮特殊作用,還可刺激優(yōu)勢卵泡顆粒細(xì)胞上的孕激素受體的表達(dá)[17]。可見，F(xiàn)SH、LH、E2及P等性激素共同協(xié)作參與卵泡的生長、發(fā)育及成熟，而補(bǔ)腎健脾中藥可有效改善排卵障礙大鼠FSH、E2等性激素水平，考慮主要與補(bǔ)腎中藥有密切關(guān)系，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)較多補(bǔ)腎中藥均可發(fā)揮雌激素樣作用參與下丘腦-垂體-卵巢性生殖軸之間的調(diào)節(jié)[18]。綜上研究，我們認(rèn)為補(bǔ)腎健脾之類中藥，可以使胞宮得以溫煦，氣血得以濡養(yǎng)，故卵巢形態(tài)學(xué)有恢復(fù)趨勢，性激素水平得以改善。

綜上所述，本研究通過數(shù)據(jù)挖掘卵泡發(fā)育不良的用藥規(guī)律，揭示了該病病機(jī)以腎虛為主，臨床施治時需要以補(bǔ)腎為要，兼顧健脾、疏肝、活血之法。聚類分析獲得補(bǔ)腎健脾方可有效改善雄激素所致排卵障礙大鼠卵泡形態(tài)，促進(jìn)卵泡發(fā)育，改善血清激素水平。為臨床治療卵泡發(fā)育不良，改善女性生殖生育功能提供科學(xué)支撐。但由于數(shù)據(jù)庫文獻(xiàn)缺乏疾病與中藥量效關(guān)系研究，并且藥物成分、藥代動力及藥理機(jī)制等受中藥炮制、用藥途徑、配伍等影響，今后需要聯(lián)合基礎(chǔ)實驗、血清藥理學(xué)進(jìn)一步驗證。