辣椒素改善實驗小鼠急性肺損傷氧化應激的研究

李利玲 劉 歡 廖慧敏 胡金鑫 劉鳳曉 趙 棋 高 強

(1 湖南中醫藥大學，長沙，410208；2 中南大學，長沙，410083)

內毒素所致肺損傷發生比較迅速，挽救的時間窗口比較短暫，同時肺損傷也是內毒素小鼠死亡的主要原因之一。各種因素導致的急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)共同病理改變為廣泛嚴重的肺泡損傷和間質性肺水腫，肺泡腔內大量炎癥細胞浸潤，灌洗液中的炎癥介質明顯增多，肺泡上皮細胞凋亡或死亡[1-2]。內皮細胞學說則認為內皮或上皮細胞的凋亡，直接造成了肺泡上皮或內皮屏障功能障礙，血管通透性增加，肺水腫加劇[3]。本實驗通過采用腹腔注射內毒素方法制造白化的家鼠亞系(Bagg Albino，Laboratory-bred Strain of the House Mouse，BALB/c)小鼠ALI模型，用辣椒素干預后硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid，TBA)化學比色法檢測小鼠丙二醛(Malondiachehyche，MDA)水平；一氧化氮還原酶法測定氮氧化物(Nitrogen Oxide,NOX)水平；酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測各組小鼠肺組織腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)水平，以及在光鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學改變，以期為辣椒素干預內毒素所致ALI小鼠氧化應激反應改善提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 120只無特定病原體(Specefic Pathogen Free，SPF)級BALB/c小鼠，4～6周齡，雄性，體質量18～22 g，購自武漢蜂鳴生物科技有限公司，動物購買許可證號SCXK(湘)2018-0003，動物使用許可證號SYXK(湘)2018-0004。倫理審批號：HN.No20180930b1000120，于湖南中醫藥大學SPF級動物房中飼養，給食顆粒飼料，自由飲水，動物房溫度(25±1)℃，相對濕度40%～70%，自然晝夜光照。

1.1.2 藥物 辣椒素(上海源葉生物科技有限公司，貨號：B2069)和脂多糖(福州奧研實驗器材有限責任公司，貨號：HX100003929)。

1.1.2 試劑與儀器 一氧化氮(Nitric Oxide，NO)測定試劑盒(硝酸還原酶法，南京建成生物工程研究所，貨號A012)和MDA測定試劑盒(TBA法，南京建成生物工程研究所，貨號:YBA003-1)，TNF-α ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，貨號:EMC102a)、IL-1β ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，貨號:EMC001b)，4%多聚甲醛組織固定液(長沙國昌生物技術有限公司，貨號:AR1069)。倒置顯微鏡(OLYMPUS公司，日本，型號:CX23)，全自動石蠟切片機(SLEE公司，德國，CUT6062型號)等，全波長酶標儀(Thermo公司，美國，型號:Multiskan Sky)，攤片機(SKU公司，美國，型號:KD-PⅢ)，電熱恒溫培養箱(崢嶸儀器公司，型號:DHP260)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將小鼠120只采用隨機數字法分為4組：正常對照組，辣椒素對照組，內毒素急性肺損傷組，辣椒素+內毒素干預組，每組30只。

1.2.2 給藥方法 正常對照組：小鼠腹腔注射生理鹽水，分別于干預后22 h、4 h、6 h時麻醉處死；辣椒素對照組：先給小鼠皮下注射辣椒素1.0 mg/kg，30 min后腹腔注射生理鹽水，分別于干預后2 h、4 h、6 h時麻醉處死；急性肺損傷組：給小鼠腹腔注射內毒素10.0 mg/kg，構建ALI模型，分別于干預后2 h、4 h、6 h分批麻醉處死；辣椒素干預組：先小鼠皮下注射辣椒素1.0 mg/kg，30 min后腹腔注射內毒素10.0 mg/kg，分別于干預后2 h、4 h、6 h分批麻醉處死。以上各組處死后取肺組織，固定于4%多聚甲醛中，4 ℃保存備用。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 比色法檢測MDA含量 按照實驗分組，取10%肺組織勻漿，用二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法測定其蛋白含量，采用比色法，檢測肺組織MDA水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。機體產生的氧自由基能通過脂質過氧化物的分解產物MDA引起細胞損傷。因而測試MDA的量常常可間接地反映出細胞損傷的程度。過氧化脂質降解產物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰。實驗取樣品100 μL，按比例加入試劑一、試劑二、試劑三，旋渦混勻器混勻，95 ℃水浴40 min，3 500～4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取上清100 μL，532 nm處，測各管光密度(Optical Density，OD)值。見表1。

1.2.3.2 NO還原酶法檢測NOX水平 按照實驗分組，摘眼球取血，離心取血清，用NO還原酶法測定NOX水平，按照試劑盒說明書操作。取血清原液100 μL，按步驟加入樣本一100 μL，樣本二200 μL，混合試劑，37 ℃水浴60 min，再加入R3、R4，抽提室溫靜置40 min，3 500～4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取上清160 μL，加入顯色劑，靜置10 min，550 nm測各管OD值。見表2。

1.2.3.3 ELISA法檢測TNF-α、IL-1β水平 按照實驗分組，取10%肺組織勻漿，用BCA法測定其蛋白含量，采用QuantiCyto? ELISA試劑盒雙抗夾心法檢測肺組織TNF-α和IL-1β水平，按照試劑盒說明書操作。抗小鼠TNF-α和IL-1β單抗包被于酶標板上，標本中的TNF-α和IL-1β與單抗結合，洗滌，加入生物素化的抗小鼠TNF-α和IL-1β抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素，洗滌，加入顯色底物，洗滌，加終止液，若陽性則顯黃色，陰性無色，在450 nm處測OD(光密度)值。見表3～4。

1.2.4 病理學觀察 按照實驗分組，將肺組織于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，進行切片和HE染色，在放大400倍光鏡下觀察肺組織病理學改變。

2 結果

2.1 辣椒素干預前后小鼠肺組織MDA、NOX、TNF-α、IL-1β比較 與正常對照組比較，內毒素組小鼠肺組織MDA水平明顯升高(P<0.05)，辣椒素對照組則變化不明顯(P>0.05)，與內毒素組比較，辣椒素+內毒素干預組小鼠肺組織MDA水平在2 h、4 h、6 h明顯降低(P<0.05)。與正常對照組比較，內毒素組小鼠肺組織NOX水平明顯升高(P<0.05)，辣椒素對照組則無明顯變化(P>0.05)，與內毒素組比較，辣椒素+內毒素干預組肺組織NOX水平在4 h、6 h明顯降低(P<0.05)。與正常對照組比較，內毒素組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P<0.05)，辣椒素對照組則變化不明顯(P>0.05)，與內毒素組比較，辣椒素+內毒素干預組小鼠肺組織在4 h、6 h TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺組織MDA、NOX、TNF-α、IL-1β水平變化及辣椒素干預結果

2.2 各組小鼠肺組織病理學改變 光鏡下，正常對照組、辣椒素組肺組織結構清晰，肺泡腔內無炎癥細胞浸潤，無出血或有少量出血，肺間質無明顯滲出；急性肺損傷組2 h損傷不明顯，但4 h、6 h可見肺泡腔大小不等，部分肺泡壁斷裂呈氣腫狀，部分增寬，肺泡毛細血管擴張，部分肺泡內可見出血，肺間質水腫，可見炎癥細胞浸潤；與急性肺損傷組比較，辣椒素干預組肺泡壁增厚、毛細血管擴張、炎癥細胞浸潤及肺間質水腫程度均明顯減輕。見圖1。

圖1 不同組別不同處理時間小鼠肺組織病理學變化(HE染色，×400)

3 討論

ALI是呼吸系統疾病中最常見的導致死亡的原因之一，同時ALI也是肺炎和急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)等其他疾病發展的重要風險因素[4-5]。由于其病情發展迅速同時病死率較高，其發病機制仍處于探討之中，同時缺乏明確的治療手段，因此目前在呼吸疾病中越來越受到重視。

此前已有研究表明氧自由基損傷是ALI的一個重要因素，其細胞脂質過氧化的降解產物主要就是MDA，其大小可以間接反映細胞氧化損傷的程度[6]。降低ALI細胞和大鼠模型中MDA和NO的水平，抑制SOD活性，可明顯減輕內毒素所致的肺組織病理改變[7]，本研究中小劑量辣椒素作用于ALI模型小鼠后可降低血清MDA水平，可以在一定程度上減輕ALI造成的氧化應激損傷。

Wu等[8]研究發現辣椒素對小鼠體內的2種NO合酶均有促進作用。而Demirbilek等[9]采用不同劑量辣椒素干預膿毒癥大鼠，發現小劑量辣椒素可以抑制大鼠血清NOX水平，但具體機制不明。唐婧等[10-11]研究不同處理因素對脂多糖誘導巨噬細胞后相關炎癥介質表達的影響，明確辣椒素的抗炎效應表明辣椒素具有抗炎的作用，并發現瞬時受體辣椒素電位1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1，TRPV1)是辣椒素在治療ALI/急性呼吸窘迫綜合征作用中的新靶點。南超等[12]初步研究過辣椒素對小鼠ALI氧化應激的影響，測定了辣椒素作用下肺組織SOD、MDA以及血紅素氧合酶等的表達變化，發現辣椒素有改善小鼠ALI氧化應激的作用，但沒有進一步測定NOX、TNF-α、IL-1β等與氧化應激相關關鍵因子的表達變化，因此本研究的完成對于進一步探索辣椒素改善小鼠ALI氧化應激的作用就顯得特別有意義。

本實驗發現小鼠體內NOX水平變化趨勢為急性肺損傷組>辣椒素加急性肺損傷組>辣椒素組>正常對照組。血漿NOX水平的升高可能與多器官衰竭的發生有關，小劑量的辣椒素降低了ALI小鼠血漿中的NOX水平，其可能的機制是小劑量的辣椒素干預可能使小鼠產生較小數量的細胞因子，例如TNF-α、IL-1β等，從而減少NOX產生。

目前的主流觀點認為，內毒素注射入人體后會導致全身炎癥反應，表現為全身炎癥反應綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，刺激機體釋放炎癥介質，從而引發瀑布樣級聯反應，使肺泡上皮細胞及血管內皮細胞受損，間隙增大，大分子物質透過血管進入肺間質及肺泡內，從而引起肺部一系列的病理生理改變[13-14]。內毒素引起ALI動物肺泡腔和間質中性粒細胞募集、肺泡壁變薄和蛋白水腫液聚集在肺泡腔[15-16]；上皮細胞在動物注入內毒素后迅速凋亡并先于其他組織損傷發生[17]。

在實驗中，通過腹腔注射辣椒素觀察其對內毒素所致ALI小鼠的改善作用，結果顯示，辣椒素能夠降低實驗小鼠中血清的炎癥介質TNF-α、IL-1β的水平，同時提高抗炎癥介質水平，說明了辣椒素可以調節炎癥介質及抗炎癥介質的平衡，從而減輕炎癥反應，發揮對肺組織的保護作用。

本研究的實驗結果中，辣椒素能調控炎癥介質TNF-α、IL-1β等的釋放，減輕內毒素所致肺損傷的炎癥程度，降低ALI小鼠肺組織MDA和NOX水平，從而阻斷肺損傷繼續進展為ALI/ARDS，因而小劑量辣椒素對ALI有一定的保護作用。目前已有研究人員從磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB)以及核因子κB等信號通路對黃酮類等對脂多糖誘導小鼠ALI的保護作用機制進行了研究[18-20]。下一步我們擬繼續對辣椒素改善實驗小鼠ALI氧化應激的機制進一步研究。