基于網絡藥理學探究王琦院士治療精液不液化核心組方的作用機制及實驗驗證

劉柘君 劉振權 鄭燕飛 沈真如 佟科錦 唐 田 于淑俊 王帥強 湯軼波

(1 北京中醫藥大學中醫學院，北京，100029；2 北京中醫藥大學中藥學院，北京，100029)

精液不液化是指男性禁欲3～5 d后排出體外的精液，置于室溫60 min內不能產生液化的現象[1]。正常情況下，精液以液體的形式存在于男性的生殖道內，射精時即為一種均勻黏稠的淡黃色或灰白色液體，射精后立即變為膠凍狀，5～20 min后再次液化[2]。精液最開始的液體狀態利于男性的射精，而后的膠凍狀利于精液在女性陰道的停留，精液第2次的液化則利于精子在女性宮頸內的游動，使女性受孕。而一旦精液無法液化，則影響精子的釋放，導致精子的有效運動下降，干擾精卵結合，最終導致不孕不育[3]。

本研究根據“中醫傳承輔助平臺系統(V2.5)”中的“組方規律”功能對王琦院士門診期間收治精液不液化患者病歷處方進行數據挖掘，基于關聯規則分析得出王琦院士治療精液不液化的核心組方，該方由黃芪、當歸、巴戟天、菟絲子和枸杞子5味藥組成[4]。

網絡藥理學能使復雜的組方成分降維，通過多靶點、多通路的方法多層次進行研究，而分子對接技術可使活性成分與靶點之間的結合狀態具體化和可視化，因此本研究通過網絡藥理學和分子對接技術，探究王琦院士治療精液不液化核心組方的作用機制，同時針對所得出的作用靶點及信號通路開展動物實驗進行驗證，以便為核心組方的臨床應用提供更多的理論數據支撐。

1 資料與方法

1.1 核心組方組成藥物靶點收集 進入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)中，檢索核心組方中當歸、黃芪、巴戟天、菟絲子、枸杞子5味中藥的化學成分。根據TCMSP數據庫提供的藥代動力學(吸收、分布、代謝、排泄)相關數據，篩選口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18的化學成分。通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)將篩選得出的化學成分所對應靶蛋白轉化為基因名稱進行信息統一規范。

1.2 構建核心組方成分-靶點網絡圖 將“1.1”篩選得到的活性成分轉化得到基因名稱形成網絡文件和屬性文件后，輸入Cytoscape 3.7.2軟件中，構建核心組方“活性成分-靶點”網絡圖，點擊“Network Analyzer”功能對網絡分析，計算自由度(Degree)值，該值越大則該節點越重要，并以不同形狀和顏色的節點表示核心組方活性成分和作用靶點。

1.3 精液不液化疾病靶點收集并構建韋恩圖 精液不液化相關疾病靶點以“nonliquefaction of semen”“sperm liquefaction retardation”及“abnormal sperma liquefaction”與精液不液化相關的疾病作為關鍵詞，檢索GeneCard數據庫(https://www.genecards.org/)及在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)(https://omim.org/)后剔除重復靶點，以獲取精液不液化相關疾病靶點。并利用在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對藥物靶點與疾病靶點進行映射，獲得交集靶點并繪制韋恩圖。

1.4 構建“藥物靶點-疾病靶點”蛋白質-蛋白質相互作用網絡 將核心組方藥物靶點與疾病靶點的交集靶點即組方治療疾病的作用靶點通過String Version平臺(https://string-db.org/)構建蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡，選擇研究物種為“Homo sapiens”，并將下載的interactions.tsv文件導入Cytoscape 3.7.2軟件可視化PPI網絡，點擊“Network Analyzer”功能對網絡進行分析，節點越大顏色越深，說明度值越高則該靶點越重要。

1.5 對交際靶點進行基因本體富集分析和京都基因和基因組百科全書富集分析 通過R語言平臺運用Cluster Profiler程序包進行基因本體(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析，設定閾值P<0.05對結果進行處理和可視化分析。

1.6 構建核心組方成分-核心靶點-疾病通路網絡 將富集的KEGG信號通路根據count值排序，并將排序前15條通路作為主要疾病通路。將核心組方成分、作用靶點及疾病通路分別進行一一對應后導入Cytoscape 3.7.2軟件，采用Merge功能合并網絡，構建成分-靶點-疾病通路網絡進行可視化分析。

1.7 分子對接驗證 將1.6中的核心組方成分-核心靶點網絡中篩選度值最高的5個成分作為核心組方的關鍵成分，在PPI網絡中篩選度值最高的5個靶點作為核心靶點。在蛋白質結構數據庫(Protein Data Bank，PDB)(https://www.rcsb.org/)和Uniprot網站分別下載5個關鍵成分的3D結構圖以及5個關鍵靶點的蛋白結構圖，使用AutoDockTool軟件對關鍵成分及核心靶點進行對接，并使用Pymol軟件對對接的結果進行繪圖和分析。

1.8 驗證實驗

1.8.1 材料

1.8.1.1 動物 本實驗所涉及的44只雄性7周齡，體質量(180±200)gSprague Dawley大鼠購自北京斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證編號：SCXK(京)20190010，動物購買后適應性喂養7 d，飼養過程中大鼠均自由進食飲水，飼養室恒溫恒濕，溫度維持在20～25 ℃，濕度維持在55%。經北京中醫藥大學動物倫理委員會批準，該動物實驗符合動物實驗倫理學要求(倫理審批號：BUCM-4-2022071306-3020)。

1.8.1.2 藥物 核心組方藥物組成及劑量分別為當歸20 g、黃芪20 g、巴戟天20 g、菟絲子20 g、枸杞子20 g，以上藥物均采用單味顆粒劑進行配伍，所有中藥顆粒劑由北京康仁堂藥業有限公司統一生產并提供，生產批號分別為：當歸，21018391；黃芪，21025221；巴戟天，21015111；菟絲子，21019621；枸杞子，21008741。

1.8.1.3 試劑與儀器 白細胞介素(Interleukin，IL)-1β試劑盒(江蘇晶美，貨號：JM-01454R1)，IL-6試劑盒(江蘇晶美，貨號：JM-01597R1)，腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)-α試劑盒(江蘇晶美，貨號：JM-01587R1)，纖溶酶原激活物抑制物-1(Plasminogen Avtivator Inhibitor-1，PAI-1)/絲氨酸蛋白酶抑制物E支成員1(Serine Protease Inhibitor Clade E Member 1，SERPINE1)試劑盒(江蘇晶美，貨號：JM-11054R1)，二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)試劑盒(普利萊，貨號：P1511-3)，完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich；美國；貨號：F5881-10X10ML)，總RNA抽提試劑(Total RNA Extraction Reagent，Trizol)(Ambion，美國，貨號：15596018)，逆轉錄試劑盒(康維世紀，貨號：CW2582M)；多功能酶標儀(Labsystems Multiskan MS，芬蘭，型號：352)，微量高速離心機(長沙湘智，型號：TG16W)，超聲波細胞破碎機(寧波新芝，型號：JY92-IIN)，渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-902)，生物分光光度計(Eppendorf，德國，型號：BioPhotometer)，熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國，型號：CFX connectTM)。

1.8.2 方法

1.8.2.1 分組與模型制備 采用隨機數字表法將24只大鼠分為空白組、模型組和核心組方組，每組8只。剩余20只大鼠處死后提取前列腺蛋白用于模型組及核心組方組大鼠造模，造模方法參照文獻[5]方法，即通過慢性前列腺炎誘導精液不液化的方法進行造模。

1.8.2.2 給藥方法 結合王琦院士臨床治療精液不液化患者常用藥物劑量，進行人與大鼠劑量換算后，得出核心組方組灌胃核心組方的劑量為10 g/kg，模型組和空白組灌胃蒸餾水，灌胃給藥4周，1次/d。

1.8.2.3 檢測指標與方法 大鼠末次給藥后隔天處死，取前列腺分為2部分于液氮中保存用于后續檢測。取各組大鼠前列腺稱定質量后稀釋5倍進行勻漿并靜置，3 000 r/min，離心半徑4.55 cm，離心15 min，取上清液使用酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、SERPINE1的水平。另一部分前列腺裝入無菌EP管，Trizol試劑盒提取前列腺組織中的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴增IL-17。PCR條件為：95 ℃預變性15 min，95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環，在72 ℃ 30 s處收集熒光信號，72 ℃延伸5 min。以空白組大鼠前列腺組織為1倍目的基因表達量的對照樣本，根據2-△△ct計算其他各組大鼠前列腺組織中目的基因IL-17 mRNA的相對表達。引物序列見表1。

表1 IL-17基因引物序列

2 結果

2.1 核心組方活性成分及其作用靶點 得到核心組方活性成分29種以及作用靶點194個。核心組方活性成分基本信息見表2。

表2 核心組方活性成分、基本信息及其度值

2.2 “核心組方成分-靶點”網絡的構建與分析 “核心組方成分-靶點”網絡包括223個點，324條邊。藍色正方形代表核心組方29種活性成分，黃色圓形代表所對應的194個靶點，核心組方成分度值大則該節點較大，則說明核心組方中該成分較重要。見圖1。

圖1 “核心組方成分-靶點”網絡

2.3 精液不液化疾病靶點及韋恩圖的構建 經檢索合并去重后，共獲得精液不液化相關基因共1 113個，核心組方作用靶點與疾病靶點進行韋恩分析后得到核心組方治療精液不液化的24個交集靶點。見圖2。

圖2 精液不液化與核心組方交集靶點韋恩圖

2.4 “藥物靶點-疾病靶點”PPI網絡 通過24個交集靶點初步構建的PPI網絡包括24個點，137條邊。見圖3。進一步可視化處理后網絡包括22個點，274條邊。顏色越深節點越大，則表明該節點degree值越高。見圖4。

圖3 基于String的PPI網絡

圖4 核心組方治療精液不液化的PPI網絡

2.5 GO富集分析及KEGG富集分析結果 獲得GO基因功能注釋共21條，KEGG通路富集分析30條，顏色表示通路富集到的數目，數目越大則越偏向紅色見。見圖5～6。

圖5 GO基因功能注釋富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

2.6 “核心組方成分-靶點-疾病通路”網絡的構建 “核心組方成分-靶點-疾病通路”網絡包括238個點，444條邊。黃色三角形代表194個靶點，粉色正方形代表15條疾病通路，藍色六邊形代表核心組方的29個成分。見圖7。

圖7 “核心組方成分-靶點-疾病通路”網絡

2.7 核心組方關鍵成分和核心靶點的分子對接驗證 將5個關鍵成分和5個核心靶點進行分子對接并按照結合能進行排序，結果表明關鍵成分中的槲皮素、β-谷甾醇和異鼠李素與5個核心靶點之間結合性較好。見表3。圖8可知，將結果進行可視化后顯示槲皮素、β-谷甾醇和異鼠李素與5個核心靶點蛋白殘基通過氫鍵形成穩定構象。

表3 分子對接最佳構象組合(1 cal=4.184 J)

圖8 分子對接構象圖

2.8 驗證實驗結果

2.8.1 核心組方對于模型組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、SERPINE1的影響 與空白組比較，模型組大鼠前列腺組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α、SERPINE1水平顯著增加(均P<0.05)；與模型組比較，核心組方組大鼠前列腺組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α、SERPINE1水平則顯著下降(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠前列腺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SERPINE1水平

2.8.2 核心組方對于模型組大鼠IL-17 mRNA表達量的影響 與空白組比較，模型組大鼠前列腺組織中IL-17 mRNA表達量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，核心組方組大鼠前列腺組織中的IL-17 mRNA表達量顯著下降(P<0.05)。見表5，圖9。

表5 各組大鼠前列腺組織中IL-17 mRNA表達量

圖9 各組大鼠前列腺組織中IL-17 mRNA表達量

3 討論

中醫文獻中雖無精液不液化癥名，但精液不液化屬于“精滯、精寒、精熱”等疾病的范疇，精液亦屬于津液，津液的液化通過陽氣的氣化作用來推動，氣化作用又和機體的陰陽協調密切相關，同理，精為腎之所屬，精液的液化又有賴于腎的氣化功能，因此王琦院士治療精液不液化時著眼于腎陰陽失調，氣化失常的病機[4]，核心組方中的當歸、黃芪氣血雙補調和陰陽，滋養后天氣血以養先天腎精，巴戟天補腎填精益筋骨，加之菟絲子、枸杞子滋腎陰益腎陽使氣機暢通，符合王院士對于精液不液化“扶正祛邪、恢復氣化功能”的治療原則。而西醫治療精液不液化常從慢性前列腺炎、精索靜脈曲張等引起精液不液化的病因入手，用藥上常選擇喹諾酮類抗生素和維生素，通過抗炎和抗氧化進行治療，但長時間服用抗生素易引發不良反應，影響男性生精功能和精子質量；技術層面常采用人工授精技術，但花費較高、成功率低[6]。中草藥成分復雜，具有多環節多靶點多通路的特點，因此在治療精液不液化上更加具有優勢。網絡藥理學可將組方有效成分、對應靶點、疾病通路進行系統整合，進一步揭示藥物的系統性藥理機制[7-8]，為中醫藥治療疾病的機制探究提供了新的思路和啟發。

本研究前期將王院士門診收治的精液不液化患者病歷導入“中醫傳承輔助平臺系統(V2.5)”后通過關聯規則分析的方法進行數據挖掘，得出由當歸、黃芪、巴戟天、菟絲子和枸杞子組成的核心組方。結果顯示該方關鍵活性成分主要是槲皮素、山柰酚、異鼠李素、黃豆黃素等黃酮類化合物以及β-谷甾醇的甾體類化合物。有研究表明槲皮素具有抗氧化和抗炎作用，能減輕大鼠睪丸和附睪的氧化應激程度，減少氧化產物的產生，經槲皮素治療后炎癥介質的產生和表達均有明顯的下降[9-10]。山柰酚能抑制晚期糖基化終末產物(Advanced Glycation End Product，AGE)的形成，具有較強的抗氧化作用，能減少細胞內脂類和DNA的氧化損傷，抑制前列腺增生和前列腺癌的發展，有利于雄性生殖功能損傷的恢復[11-12]。異鼠李素能緩解由TNF、IL-6、IL-1β等炎癥介質引起的炎癥反應過表達，并誘導前列腺癌細胞凋亡[13]。黃豆黃素能通過對雄激素受體信號通路的介導，阻斷雄性激素依賴性基因的表達，起到預防和治療前列腺癌的作用[14]。β-谷甾醇對雄性白化大鼠進行治療后可使精子水平和睪丸體質量增加，能夠減輕生殖系統的損傷，促進生殖功能的恢復[15]。

通過對核心組方藥物成分、靶點與疾病靶點的總體綜合分析，共得出24個交集靶點，將交集靶點輸入String網站后將網站生成文件導入Cytoscape 3.7.2，根據靶點degree值進行排序得出TNF、SERPINE1、IL-6、IL-1β是關鍵靶點。關鍵靶點中的炎癥介質TNF、IL-6和IL-1β與前列腺炎的發生發展密不可分[16]，前列腺炎會引起白細胞數量增加，導致前列腺上皮細胞功能異常，減少以前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)和前列腺酸性磷酸酶為主的蛋白分解酶生成及分泌，最終造成精液不液化[17]。根據流行病學調查研究表明，90%的精液不液化患者有前列腺炎，慢性前列腺炎患者中約有23.16%的患者會產生精液不液化[18]。SERPINE1是一種調節纖維蛋白溶解的遺傳糖蛋白，是纖維蛋白溶解酶原激活因子類特異性抑制物[19]。纖維連接蛋白(Fibronectin，FN)、精膠蛋白(Semenogelin，Sg)等是精囊腺分泌的主要蛋白，是引起精液凝固的原因，精液液化時FN也會隨之降解為多肽片段，當PSA作為水解底物時，FN水平與精液液化程度和精子活動率密切相關[20-21]，因此FN等蛋白的及時降解有利于精液的及時液化。有研究認為當精液中的SERPINE1/PAI-1水平增高時，會使精液中的纖溶酶等蛋白水解酶活性受到抑制，導致精液中的纖維蛋白無法及時降解為多肽片段，造成精液液化時間的延長[22]。分子對接結果進一步驗證了核心組方關鍵活性成分與核心靶點TNF、SERPINE1、IL-6、IL-1β和血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)A具有良好的親和力，當結合能小于-5.0 kcal/mol(1 cal=4.184 J)時說明具有較好的結合活性，小于-7.0 kcal/mol時則提示配體與受體之間具有強烈的結合活性[23]。因此分子對接結果可表明，核心組方關鍵活性成分與核心靶點之間具有較好的結合性，能形成較為穩定的構象，在抗炎和調節纖維蛋白方面具有較好的作用效果。課題組前期臨床研究和實驗研究表明，核心組方能有效改善精液不液化，因此，在此基礎上開展藥理驗證性實驗，對核心靶點及信號通路進行驗證，結果表明經該方干預后，模型組大鼠前列腺組織中的TNF-α、SERPINE1、IL-6、IL-1β水平顯著性降低(均P<0.01)，說明核心組方中主要成分的作用靶點與精液不液化的疾病基因關聯度較高，即本研究方法具有一定的可信度。

核心組方治療精液不液化的過程涉及多個信號通路，包括糖尿病并發癥晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終產物受體(AGE-receptor for Advanced Glycation End Products，AGE-RAGE)信號通路及炎癥通路IL-17信號通路等通路。研究表明AGE暴露后與RAGE相互作用通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路誘導前列腺癌細胞的生長和增殖[24]。IL-17由輔助性T細胞17(T Helper Cell，Th17)分泌，在炎癥性腫瘤中，IL-17與受體結合后經信號通路轉導誘導靶細胞合成釋放炎癥介質如TNF-α、IL-1等，并促進VEGFA的表達以生成新的血管[25]。此外有研究表明，IL-17及其受體在前列腺癌組織中表達顯著增加，與前列腺癌關系密切[26]，實時熒光定量-PCR實驗結果表明經核心組方治療后模型組大鼠前列腺組織中IL-17 mRNA表達量顯著下調，說明由網絡藥理學所得出的IL-17信號通路是核心組方治療精液不液化的主要作用通路之一，再一次驗證了本研究的可行性。

本研究通過網絡藥理學對王琦院士治療精液不液化核心組方成分、靶點、通路和機制進行探索，根據分子對接技術對關鍵成分和核心靶點之間的結合程度進行分析和驗證。預測發揮治療作用的關鍵成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素和黃豆黃素，作用的核心靶點可能是TNF、SERPINE1、IL-6、IL-1β等，關鍵通路是糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路及IL-17信號通路等，且通過動物實驗發現經核心組方給藥后大鼠前列腺組織中的TNF、SERPINE1、IL-6、IL-1β水平及IL-17 mRNA表達量均顯著下降，與網絡藥理學研究結果存在一致性，說明核心組方成分通過對應靶點可直接或間接作用于疾病信號通路，圍繞抗炎、抗氧化以及調節纖維蛋白等生物學進程多層次、多環節地治療精液不液化。

綜上所述，本研究為臨床治療精液不液化提供新的理論數據和科學根據，也進一步傳承王琦院士的學術經驗。