HPLC法同時測定不同產地菝葜中5種成分的含量

時向利，朱 倩

（1.江蘇康緣醫藥商業有限公司質量部，江蘇連云港 222000；2.江蘇康緣藥業股份有限公司質量部，江蘇連云港 222000）

菝葜為百合科植物菝葜Smilax chinaL.的干燥根莖，具有利濕去濁、祛風除痹、解毒散瘀之功效，用于小便淋濁、帶下量多、風濕痹痛、疔瘡癰腫[1]，臨床上用于慢性盆腔炎、附件炎等疾病的治療[2-3]。菝葜中主要含有黃酮類、有機酸類和皂苷類化學成分[4-5]，具有抗炎、抗腫瘤的作用[5-7]。2020年版《中國藥典》菝葜質量標準中未收載含量測定項，難以全面控制菝葜的質量，菝葜含量測定方面的文獻報道主要有白藜蘆醇和黃酮類成分的含量測定[8-9]，本文以菝葜中活性成分綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷為對象，建立同時測定菝葜中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷5種成分含量的方法，研究不同產地菝葜中5種成分的含量，可用于控制菝葜的質量。

1 儀器和試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，DAD檢測器；梅特勒MS105DU型電子分析天平；德意生040S型超聲波清洗機。

綠原酸（批號110753-202018，含量以96.1%計）、落新婦苷（批號111798-201805，含量以93.6%計）、黃杞苷（批號111906-201102，含量以93.7%計）和白藜蘆醇（批號111535-201703，含量以99.4%計），中國食品藥品檢定研究院；異黃杞苷（批號20210615，純度≥98%），購自北京謹明生物科技有限公司。乙腈和磷酸為色譜純，水為娃哈哈純凈水，甲醇為分析純。

22批菝葜藥材產地信息如下：S1，S2：安徽亳州；S3：安徽潛山；S4：安徽霍山；S5：安徽宣城；S6，S7：湖南岳陽；S8：湖南株洲；S9：湖南韶山；S10：湖南邵陽；S11：云南大理；S12：云南普洱；S13：云南昆明；S14：貴州遵義；S15：貴州興義；S16：貴州遵義；S17：四川綿陽；S18：四川德陽；S19：湖北宜昌；S20：湖北蘄春；S21：江西贛州；S22：江西南昌。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（4.6×150mm，3.5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液；梯度洗脫，0～8min：6%→10%乙腈；8～35min：10%→35%乙腈；柱溫35 ℃；流速1.0mL/min；檢測波長303nm；進樣量為10μL。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 溶液配制

混合對照品溶液：取綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷對照品，精密稱定，用甲醇溶解制備為混合對照品溶液，濃度分別為100μg/mL、500μg/mL、100μg/mL、60μg/mL 和25μg/mL。

供試品溶液：取菝葜藥材粉末約1.5g，精密稱定，移至帶塞的三角瓶中，精密量取甲醇50mL加入三角瓶中，稱重，超聲提取50min，放冷后再稱重，用甲醇補重，搖勻，放置，取適量上清液離心，即得。

2.3 精密度試驗

取混合對照品溶液進行進樣分析，連續進樣6針。色譜圖中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷的峰面積RSD分別為0.65%、0.71%、0.92%、0.69%和1.03%。

2.4 線性關系的考察

精密稱取落新婦苷11.75mg，轉移至100mL容量瓶內，加甲醇使溶解后稀釋至刻度，作為落新婦苷母液。分別精密稱取綠原酸、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷對照品13.00mg、11.69mg、12.49mg和6.61mg，轉移至同一50mL容量瓶內，加落新婦苷母液制成X1溶液，將X1溶液用甲醇逐倍稀釋得X2、X3、X4、X5、X6和X7溶液，分別進樣測定。用各指標成分的峰面積對濃度（μg/mL）進行線性回歸，結果如下：綠原酸回歸方程Y=24.5598X+10.7828，r=0.9999，范圍3.90～249.86μg/mL；落新婦苷：回歸方程Y=9.1233X- 1.4909，r=1.0000，范圍17.19～1100.20μg/mL；黃 杞 苷：回 歸 方 程Y=15.7221X+0.4547，r=1.0000， 范 圍 3.42～219.00μg/mL ； 白藜蘆醇：回歸方程Y=16.0187X-1.1474，r=0.9997，范 圍3.88～248.40μg/mL；異 黃 杞 苷：回 歸 方 程Y=8.3343X+1.0147，r=0.9999， 范 圍 2.07～132.24μg/mL。

2.5 穩定性試驗

取編號為S1的菝葜藥材粉末，制備一份供試品溶液，室溫條件下放置0h、4h、8h、12h和16h時，進樣分析。計算5個時間點所得圖譜中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷峰面積的RSD，結果分別為1.58%、1.22%、1.37%、1.94%和1.16%。

2.6 重復性試驗

取編號為S1的菝葜藥材粉末6份，制備供試品溶液，進樣分析，計算每份樣品中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷的含量和6份樣品的平均含量。6份供試品中，5個指標成分的平均含量分別 為 4.72mg/g、16.39mg/g、5.24mg/g、2.81mg/g和1.06mg/g，RSD分別為1.56%、1.19%、1.74%、1.82%和2.09%。

2.7 回收率試驗

取編號為S1的菝葜藥材粉末6份，每份取約0.75g，精密稱定，分別加入混合對照品母液2.0mL，制備供試品溶液，進樣分析。結果見表1。

表1 加樣回收率結果（n=6）

2.8 樣品測定

取表1中22批菝葜藥材粉末進行測定，結果見表2。

表2 22批菝葜中5個指標成分的含量（單位：mg/g，n=2）

續表

從表2可知，5種指標成分的含量分別為0.52～6.89mg/g、0.63～34.18mg/g、0.27～7.16mg/g、0.84～4.32mg/g 和0.087～1.78mg/g。從5種成分的均一程度來分析，均一性最好的為安徽產地的5批菝葜藥材，其他產地的藥材差異較大。

3 結論

采用全波長掃描方式，采集綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷在190～400nm的吸收光譜，根據5種成分的紫外吸收曲線選擇303nm作為含量測定的檢測波長。在進行色譜柱優選時，粒徑為5μm的色譜柱所得色譜圖中需測定的指標成分分離效果差，達不到定量分析的要求，粒徑為3.5μm的色譜柱所得色譜圖中5個指標成分的分離度均能達到定量要求。

本文建立了HPLC方法同時測定不同產地菝葜中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷的含量，并進行了完整的方法學驗證。從測定的22批菝葜藥材中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷的含量結果可知，白藜蘆醇含量差異最小，含量最高與最低差異約為5倍，落新婦苷含量差異最大，含量差異高達五十多倍，可能與生長環境、土壤和采收季節等多種因素有關。菝葜藥材存在良莠不齊的現象，應引起重視。