生酮飲食對裸鼠人結腸癌皮下瘤生長的影響及作用機制

王楷，黃思輝，吳騰飛，邱振雄（通信作者）

深圳市寶安區中心醫院·廣東醫科大學附屬寶安中心醫院普外科 （廣東深圳 518000）

結腸癌是全球第三大常見癌癥，也是癌癥疾病中致死率排名第二的癌癥[1]。迄今為止，化療仍是治療結腸癌的主要手段，除此之外，缺乏更有效、更安全的治療方法，因此，亟需探索結腸癌治療的新方式[2-4]。飲食影響著人類健康的各個方面，有證據表明，飲食可能會導致細胞發生表觀遺傳變化，從而改變某些調控細胞增殖和生長的基因的表達水平，多項研究表明，飲食與多種癌癥（如胰腺癌、結腸癌、乳腺癌等）存在著密切聯系[5-6]。通過低碳水化合物、平均蛋白質和高脂肪飲食抑制腫瘤生長的飲食方式被稱為生酮飲食（ketogenic diet，KD）。以往對KD 的研究主要集中于癲癇的治療方面[7-10]。近年來，KD 逐漸被用于腫瘤的治療，如胃癌、前列腺癌、神經膠質瘤等，且治療過程中未發現不良反應[11-13]。本課題前期研究也發現KD 會抑制裸鼠結腸癌移植瘤的生長，但具體的作用機制尚不明確，因此本研究將探討KD 對結腸癌細胞皮下移植瘤生長抑制作用的可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠（許可證號：SCXK（湘）2016-0002，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），10只，雄性，8周齡；飼養于溫度20～26℃，濕度 40%～70%的SPF 級環境中，自由飲食攝水。

1.2 主要試劑及儀器

生酮飼料，購于江蘇美迪森生物醫藥有限公司；HCT116細胞，購于北納生物技術有限公司；完全DMEM 培養基，購于南京凱基生物技術有限公司；TUNEL 檢測試劑盒，購于碧云天生物技術有限公司；β-catenin，購于abcam 公司；Wnt1，購于affinity 公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L），購于北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB 顯色試劑盒、中性樹脂，購于北京康為世紀生物技術有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit），購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.3 皮下注射及生酮飲食

本研究將裸鼠分為對照組和KD 組，每組5只，對裸鼠經適應性飼養7 d后，將濃度為5×106個/ml的人結腸癌細胞HCT116皮下注射到裸鼠體內成瘤（0.1 ml/只，于成瘤5 mm 時開始生酮喂養）。成瘤前兩組裸鼠均自由進食，之后成瘤對照組裸鼠自由進食標準飼料，KD 組裸鼠于成瘤5 mm 時給予相等能量的生酮飼料，飼喂30 d 后處死裸鼠。

1.4 HE 染色

參照胡清泉等[14]的方法，腫瘤組織石蠟切片經烤片、脫蠟、水化后，用蘇木素染液染色3-5 min，流水沖洗后，用1%鹽酸酒精分化，反藍液反藍，伊紅染色3-5 min 后，切片脫水，封片，在顯微鏡（BX43，Olympus）下觀察。

1.5 TUNEL 染色

參照劉艷龍和徐國海[15]的方法，將組織切片放入二甲苯進行脫蠟，接著加入梯度乙醇水化，加入抗原抗體修復后，滴加脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）檢測液，孵育2 h 后，洗滌，封片鏡檢。

1.6 免疫組化

參照胡清泉等[14]的方法，將組織切片進行脫蠟、水化和抗原修復后，利用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）進行封閉，然后進行一抗β-catenin（1‥200）和Wnt1（1‥300）、二抗辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）孵育，DAB 顯色試劑盒顯色5～10 min，再用中性樹脂封片和鏡檢。

1.7 Western Blot 免疫印跡法檢測

取兩組瘤體組織經液氮研磨成粉末，加入裂解液后再次研磨，將組織勻漿吸入一EP 管中，冰上裂解30 min 收獲上清液；采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，參照魏利超和吳旻[16]的方法檢測瘤體組織中活化的半胱氨酸蛋白酶3和9（Cleavedcaspase 3/9）、生存素（Survivin）、無翅和整合素1（Wnt1）和β-聯蛋白（β-catenin）表達情況。

1.8 統計學處理

采用Graphpad Prism 7軟件對數據進行統計分析，計量資料以±s表示，組間比較經單因素分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KD 對裸鼠結腸癌皮下成瘤病理學的影響

對照組呈實體狀排列，部分癌細胞成腺管樣分布，大量炎性細胞浸潤；KD 組結腸癌的病理特征改善，炎性細胞浸潤減少，見圖1。

圖1 HE染色觀察裸鼠結腸癌皮下成瘤的病理學變化（×200）

2.2 KD 對裸鼠結腸癌皮下成瘤細胞凋亡的影響

如圖2所示可以看出，對照組凋亡細胞占比5%左右，KD 組凋亡細胞占比25%左右，且與對照組相比，KD 組細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖2 TUNEL 染色檢測KD 對裸鼠結腸癌皮下成瘤細胞凋亡的影響

2.3 KD 對裸鼠結腸癌皮下成瘤中Wnt1和β-catenin 表達的影響

如圖3 所示可以看出，Wnt1、β-catenin 在瘤體組織中陽性表達。且在對照組中，Wnt1、β-catenin 陽性表達率均為60%左右，而在KD 組中，Wnt1、β-catenin 陽性表達率分別在25%、30%左右，與對照組相比，KD 組Wnt1 和β-catenin 表達水平均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖3 免疫組化檢測KD 對裸鼠結腸癌皮下成瘤中Wnt1和β-catenin 表達的影響

2.4 KD 對裸鼠結腸癌皮下成瘤中Cleaved-caspase 3/9、Wnt1和β-catenin 表達的影響

由Western Blot 檢測腫瘤組織中Cleaved-caspase 3/9、Wnt1和β-catenin 的表達情況可以看出，與對照組相比，KD 組中Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9表達顯著升高，Survivin 表達顯著下降，且差異都有統計學意義（P<0.05）；進一步探究Wnt1/β-catenin 信號通路是否參與這一過程，結果顯示，與對照組相比，KD 組Wnt1和β-catenin 表達水平顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05），見圖4。

圖4 Western Blot 免疫印跡法檢測KD 對裸鼠結腸癌皮下成瘤中Cleaved-caspase 3/9、Wnt1和β-catenin 表達的影響

3 討論

“Warburg 效應”是腫瘤細胞在有氧的情況下通過一系列分子機制來削弱有氧呼吸，進行高效糖酵解反應，進而獲得大量三磷酸腺苷（ATP），以及制造適合腫瘤細胞生存的微環境，使腫瘤細胞具有增殖優勢。研究發現，機體血糖與腫瘤生長速度相關，血糖濃度與腫瘤生長呈正相關，血糖濃度下降后可使腫瘤體積減小且生長速率降低[17]，因此可通過減少碳水化合物的攝入、切斷腫瘤的能量供應來破壞腫瘤微環境，從而達到抑制腫瘤生長的目的。研究發現，KD 可調節患者代謝，明顯抑制腫瘤生長，提高患者生命質量，增強患者化療敏感性[18]，因此，目前KD 已在多種動物腫瘤模型及臨床病例的治療及輔助治療中被廣泛使用[19-21]。基于以上研究，本研究認為KD 飲食對結腸癌增殖的抑制及潛在機制值得進一步探索。

本研究通過皮下注射HCT116細胞建立結腸癌模型，并于成瘤后調整飲食，即分別給予正常飲食和生酮飲食，通過HE 染色檢測對照組及KD 組瘤體的病理變化，結果顯示，對照組呈實體狀排列，部分癌細胞成腺管樣分布，大量炎性細胞浸潤；KD組炎性細胞浸潤減少，病理特征有所改善。進一步行TUNEL 實驗的結果顯示，KD 可促進瘤體凋亡。由此說明，KD 干預可延緩結腸癌細胞皮下移植瘤瘤體的生長并誘導瘤體凋亡，改善瘤體病理變化。

Wnt/β-catenin 是經典的Wnt 信號通路，在多種疾病中起重要作用，研究發現Wnt /β-catenin 在腫瘤中過度激活，抑制 Wnt /β-catenin 可阻礙腫瘤生長和轉移，對干細胞更新、細胞增殖和細胞分化都至關重要[22]。另有研究表明，Wnt/β-catenin 信號參與結直腸癌的進展，激活Wnt/β-catenin 信號可促進結直腸癌的生長和轉移[23]。細胞質后期分裂復合體（anaphase-promoting complex，APC）/軸蛋白破壞復合物（destruction complex，DC）在保持β-catenin 的穩定性方面發揮著重要作用。APC 蛋白包含3 個Axin 結合基序，這些基序散布在一系列與β-catenin 結合的15 和20 氨基酸重復序列之間。在結直腸癌中，APC 對DC 的功能至關重要；APC缺乏可導致β-catenin 在細胞質中聚集并轉移至細胞核，激活原癌基因蛋白（transcriptional regulator Myc-like，c-Myc）、細胞周期素D1（Cyclin D1）和基質金屬蛋白酶7（matrix metallopeptidase 7，MMP7）等靶基因，這些基因與癌細胞的周期、增殖、上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和轉移有關[18]。研究發現，結腸癌的發現與細胞內β-catenin 的積累水平失控有關[20-21，24]。此外，腸道的形成過程需要Wnt 信號通路的激活，但該通路過度激活后會導致腸道病變，約有90%的結腸癌患者存在Wnt 信號通路異常激活[25-28]。因此，KD 對結腸癌的抑制作用可能是通過Wnt 通路發揮作用。本研究結果顯示，KD 可顯著降低瘤體中Wnt1、β-catenin 陽性表達率，Western Blot 實驗結果進一步證實，KD 可顯著下調Wnt1、β-catenin 表達，且Western Blot 實驗結果還證實，KD 可顯著下調Survivin 表 達，上 調Cleaved-caspase 3/9 表 達。Survivin 不僅是Wnt1/β-catenin 通路靶基因，還是目前已知最強的凋亡抑制因子，可顯著抑制caspase 3的凋亡誘導作用。因此，調控上述蛋白的表達，將明顯影響腫瘤細胞的存活。本研究結果恰好證實了KD可調控Survivin、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9 表達，繼而促進結腸癌瘤體的凋亡。

綜上所述，KD 可有效促進裸鼠人結腸癌皮下瘤細胞的凋亡，與下調Survivin 表達和上調Cleaved-caspase 3/9表達有關，此過程可能是通過阻斷Wnt1/β-catenin 信號通路實現的，但需要結合Wnt1/β-catenin 通路抑制劑或相關成分抑制劑進行進一步驗證。