基于lncRNA相關ceRNA網絡預測冠心病血瘀證分子調控軸

王念，王博，冷媛媛，祁軼斐，李兵，張瑩瑩，雷蕾，王忠，劉駿

1.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；3.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；4.中國中醫科學院中醫藥信息研究所，北京 100700

冠心病是影響全球人口的主要心血管疾病之一[1]，屬中醫學“胸痹”范疇，依據勞倦、寒邪、情志、飲食等致病因素，可以辨為寒凝、痰濁、陰虛、陽虛、血瘀等不同證候[2]。現代研究表明，血瘀證患者冠脈病變及血管內皮損傷程度較其他證型重，不僅因為該病的發病關鍵在于心血瘀阻，也因為其他證型的冠心病在病情進展的過程中同樣會出現血瘀的病理特征，即血液凝滯等現象[2]。競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）包括信使RNA（mRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）、環狀RNA（cirRNA）、假基因等[3]，能夠通過應答元件（MREs）相互作用，構成ceRNA調控網絡，如微小RNA（miRNA）能夠結合mRNA導致基因沉默，ceRNA可以通過MREs與miRNA競爭性結合而解除其對基因的抑制作用，ceRNA調控機制存在于冠心病發生發展過程中。

中醫證候生物學機制是目前研究的熱點，但基于ceRNA調控網絡的研究仍然缺乏，網絡科學的進步促進了生物網絡中發現重要生物標志物及治療靶標的過程，能夠幫助分析復雜的疾病過程，以功能模塊的信息流變化體現生物反應，更加全面理解多種生物分子之間的相互作用[4]。模塊藥理學是在系統生物學指導下，對復雜生物網絡進行模塊化分析，能夠度量和整合模塊對網絡干預的特征[5]。從模塊藥理學角度分析ceRNA網絡是研究證候生物學機制的新思路，從而揭示血瘀證的復雜性和系統性。本研究通過構建lncRNA相關ceRNA網絡，即lncRNA-miRNA-mRNA網絡，利用公共數據庫發表的冠心病血瘀證相關基因，以模塊藥理學方法尋找網絡中的關鍵節點，通過文獻預測關鍵節點之間的調控關系，形成調控軸，并進行序列驗證，從轉錄組學水平揭示冠心病血瘀證的潛在機制。

1 資料和方法

1.1 數據來源

1.1.1 冠心病相關基因

以“coronary artery disease”為關鍵詞，分別通過HMDD3.2（http://www.cuilab.cn/hmdd/）[6-8]查找冠心病相關miRNA，通過DisGeNET7.0[9]（https://www.disgenet.org/）、OMIM（http://www.omim.org/）、GeneCards 5.1（https://www.genecards.org/）、TTD[10]（http://db.idrblab.net/ttd/）數據庫查找冠心病相關mRNA，通過lncRNADisease2.0（http://www.rnanut.net/lncrnadisease/index.php/）數據庫查找冠心病相關lncRNA。

1.1.2 血瘀證相關基因

以中國中西醫結合學會活血化瘀專業委員會制定的《冠心病血瘀證診斷標準》[11]的主要指標及次要指標為依據，選擇血瘀證檢索詞。以“chest pain”（胸痛）、“oppression in chest”（胸悶）、“ecchymosis on tongue”（舌生瘀斑）、“palpitation”（心悸）為關鍵詞[12]，通過OMIM數據庫檢索血瘀證癥狀表型的相關mRNA。

1.2 冠心病血瘀證相關基因獲取

比較上述方法獲取的冠心病相關mRNA與血瘀證相關mRNA，以二者相同基因作為冠心病血瘀證基因。

1.3 ceRNA網絡構建與拓撲結構分析

利用starBase3.0[13]（http://starbase.sysu.edu.cn/）平臺的miRNA-target interactions模塊、miRNAlncRNA interactions模塊、lncRNA-ceRNA interactions模塊預測lncRNA-miRNA-mRNA之間的靶標關系，建立相互作用網絡。

1.4 功能模塊識別與優化

使用Cytoscape3.7.0軟件clusterMaker插件中的3種算法MCODE（molecular complex detection）、馬爾可夫聚類（Markov cluster，MCL）及GLay算法（均以默認參數）對上述整合的冠心病血瘀證ceRNA網絡進行功能模塊識別。為得到相對穩定可靠的結果，采用課題組前期提出的最小網絡結構熵的方法[14]對以上3種模塊劃分方式進行比較，從而確定本研究所使用的模塊識別方法。計算公式：。式中，N為網絡中節點數目，Ii為第i個節點的重要度（節點的重要度定義為每個節點連接度占所有節點連接度總和的比例）[14]。

1.5 功能富集分析

利用WebGestalt[15]（http://www.webgestalt.org/）分析平臺對冠心病血瘀證ceRNA網絡中的mRNA進行GO及KEGG通路富集分析。

1.6 基于文獻預測調控軸

ceRNA調控軸預測條件：①miRNA、mRNA、lncRNA存在于同一模塊中；②檢索中文數據庫中國知識資源總庫（CNKI）、中文科技期刊數據庫（維普網）、萬方數據知識服務平臺，以及英文數據庫PubMed、Web of Science，檢索時間范圍為建庫至2021年4月，中文檢索詞為miRNA、mRNA、lncRNA的基因symbol（如“UCA1”）與“冠心病”，英文檢索詞為基因symbol與“Coronary Artery Disease”“Coronary Heart Disease”。③篩選條件為單個節點冠心病生理病理相關文獻數量≥5篇，報道lncRNA-miRNAmRNA三者之間關系（檢索詞為lncRNA and miRNA and mRNA，如“UCA1 and miR-1 and G6PD”）的文獻數量≥5篇；如果沒有直接闡述三者之間調控關系的文章，則選擇分別報道lncRNA-miRNA、miRNAmRNA調控關系的文獻（檢索詞為lncRNA and miRNA，miRNA and mRNA，如“UCA1 and miR-1”“miR-1 and G6PD”），納入文獻數量≥5篇的靶標關系對。④閱讀文獻全文，篩選符合標準的節點及調控關系，納入進行組學檢測并驗證的臨床研究性文獻，記錄文獻中驗證的靶標關系。

1.7 序列驗證

MRE是ceRNA網絡發生相互作用的關鍵因素，是構成調控作用的基礎[16]。starBase平臺中的miRNATarget版塊及lncRNA-ceRNA版塊能夠分別基于CLIPsep對miRNA-mRNA、miRNA-lncRNA互作關系進行挖掘，并提供PITA、RNA22、miRmap、DIANAmicroT、miRanda、PicTar和TargetScan等數據庫中的MRE序列比對。在miRNA-Target版塊輸入miRNA與mRNA的名稱，以默認參數檢索兩者相互作用的MRE，在lncRNA-ceRNA版 塊 中 輸 入miRNA與lncRNA的名稱，以默認參數檢索相互作用的MRE，驗證miRNA-lncRNA與miRNA-mRNA兩者的MRE是否相同，從而確定調控軸能否存在。

2 結果

2.1 冠心病及血瘀證相關基因

以“coronary artery disease”為關鍵詞在HMDD數據庫檢索得到73個冠心病相關miRNA；在DisGeNET、GeneCards、OMIM、TTD數據庫分別檢索得到1 709、6 998、1 038、21個mRNA，去除重復后共得到8 158個mRNA；在lncRNADisease數據庫檢索得到冠心病相關lncRNA 130個。通過OMIM數據庫分別檢索得到16（chest pain）、2 713（oppression in chest）、521（ecchymosis on tongue）、2 343（palpitation）個血瘀證相關mRNA，去除重復后共得到5 197個mRNA。

2.2 冠心病血瘀證相關基因

冠心病相關基因及血瘀證相關基因共有1 211個相同的mRNA，作為冠心病血瘀證相關基因。

2.3 ceRNA網絡構建與拓撲結構分析

通過starBase篩選由HMDD數據庫預測出的73個miRNA相關的mRNA及lncRNA，即冠心病相關基因之間所有的靶標關系對（miRNA-lncRNA，miRNAmRNA，lncRNA-mRNA）。HMDD數 據 庫 未 對miRNA的“-3p”“-5p”端臂加以區分，starBase數據庫對此加以區分，最終73個miRNA（不區分“-3p”“-5p”端臂）在starBase數據庫中共有72個miRNA（區分“-3p”“-5p”端臂）實現預測。此外，在ceRNA網絡構建過程中，補充了lncRNA-mRNA之間的靶標關系，使網絡更加全面、穩定。

由72個miRNA預測共得到miRNA-mRNA靶標關系271 817對，miRNA-lncRNA靶標關系82 616對，lncRNA-mRNA靶標關系58 761對。篩選同時存在于冠心病血瘀證中的mRNA及miRNA-mRNA、lncRNAmRNA靶標關系中的mRNA，交集結果見圖1。共有182個mRNA同時存在于以上三者之中，以此作為構建冠心病血瘀證ceRNA網絡的mRNA，并在預測的靶標關系對中篩選與之有靶標關系的lncRNA、miRNA，得到72個miRNA、29個lncRNA。以上述步驟篩選出的182個mRNA、72個miRNA、29個lncRNA構 建ceRNA網絡。通過Cytoscape3.7.0對網絡進行可視化處理（見圖2），并進行網絡拓撲結構分析，包括節點、度、緊密度中心性、介數中心性以及平均最短路徑長度等。該網絡共有283個節點、4 990條邊，網絡中節點最大度值為154，其中有26個節點度值≥80。節點的拓撲參數見表1。

圖2 冠心病血瘀證ceRNA網絡

通過網絡拓撲分析可以看出，lncRNANEAT1（核旁斑點組裝轉錄本1）在網絡中度值最大，表明與之相連的節點數最多，NEAT1在乳腺癌等婦科癌癥中大量表達，其可通過抑制相應的miRNA或與調節蛋白相互作用促進腫瘤的發展，是一種重要的生物標志物，亦是有前景的治療靶點[17]。在冠心病患者中，NEAT1通過激活miR-140-3p/MAPK1通路增加細胞活力并抑制冠心病細胞凋亡，能夠作為冠心病的潛在治療靶點[18]。度值≥80的節點中有23個節點是miRNA，這不僅反映miRNA與冠心病的關系密切，同時也在ceRNA網絡中起到重要的連接作用。如hsa-miR-340-5p在冠心病患者的血小板中表達上調[19]，hsa-miR-106-5p可作為炎癥標志物、hsa-miR-137可作為細胞損傷標志物，幫助診斷不穩定型心絞痛患者心肌缺血并對缺血的嚴重程度進行分層[20]。

2.4 功能模塊識別與優化

網絡結構熵值能夠有效刻畫無尺度網絡的無序性。從大網絡中識別出功能模塊的過程是系統從無序到有序的變化，是系統能量分布從均勻到不均勻的變化，是一個熵減的過程，且熵越小，系統越穩定。模塊識別的最終目的是要找到一種穩定的模塊化狀態，這種狀態具有最小的不確定性[21]。

分別計算MCODE、MCL、GLay模塊劃分的熵值，結果見表2。

表2 冠心病血瘀證ceRNA網絡3種模塊劃分方法比較

根據熵值最低原則，選擇MCODE作為模塊劃分方式。MCODE算法共識別出11個模塊（節點數≥3），見圖3。根據MCODE評分排序，最大模塊有31個節點和107條邊，評分7.133分；最小模塊有4個節點和4條邊，評分2.667分。

圖3 MCODE劃分出的冠心病血瘀證ceRNA網絡11個模塊

2.5 功能富集分析結果

GO注釋包含生物過程（BP）、細胞組分（CC）、和分子功能（MF），對冠心病血瘀證ceRNA網絡富集分析共識別出211個RNA，其中BP涉及生物調節、代謝、細胞增殖、細胞復制等過程，CC顯示分布在20個細胞組分中，MF主要集中在蛋白質結合、離子束縛、核酸結合、核苷酸結合等功能。FDR＜0.05的前10個條目見圖4。KEGG分析顯示冠心病血瘀證ceRNA網絡富集到62條通路（FDR＜0.05），集中在腫瘤、局部黏附、PI3K-Akt信號通路等方面，前10條通路見圖5。

圖4 冠心病血瘀證ceRNA網絡mRNA的GO富集分析

圖5 冠心病血瘀證ceRNA網絡mRNA的KEGG通路富集分析

2.6 基于模塊預測調控軸

模 塊1、2、6、7同 時 包 含3種RNA，因 此lncRNA-miRNA-mRNA調控軸可能存在于以上4個模塊中。對4個模塊中的基因分別進行文獻檢索，基于5個數據庫的檢索結果發現，模塊1、2、7的節點未在文獻中發現冠心病生理病理相關的上下游調控關系，模塊6中節點具有調控關系，且符合調控軸預測原則。模塊1中節點PVT1、hsa-miR-370-5p、hsa-miR-16-5p、

hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-23a-3p、TGFBR1、MTRR、MTHFR、OLR1、GCLC、APC、RAP1A均報道與冠心病生理相關，但并無文獻報道節點之間的調控關系；模 塊2中 節 點hsa-miR-130a-5p、CD46、CXCL12、CAV1、H19均報道與冠心病生理相關，但根據文獻報道的調控關系與冠心病無關；模塊7中節點HOTAIR、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-214-3p均報道與冠心病生理相關，但其之間存在的調控關系與冠心病生理病理無關。只有模塊6中UCA1、miR-1、G6PD3個節點符合調控軸預測條件，其中UCA1冠心病生理病理相關文獻報道5篇，miR-1文獻報道44篇，G6PD文獻報道5篇。UCA1-miR-1-G6PD三者之間相關關系的文獻共報道17篇，與冠心病生理病理相關的文獻5篇，符合調控軸預測要求，其中有4篇文獻經過驗證。該軸靶向關系體現如下：miR-1能夠抑制G6PD的表達，導致心肌梗死、心肌缺血等冠狀動脈疾病的發生，而UCA1能夠通過解除miR-1的抑制恢復G6PD的正常表達。驗證三者之間關系的文獻報道見表3。

表3 UCA1-mir-1-G6PD與冠心病血瘀證實驗驗證

2.7 序列驗證

MRE是RNA的重要組成部分，在ceRNA網絡基因調控中發揮重要作用，具有相同的MRE的mRNA、lncRNA、miRNA存在ceRNA調控機制，而不具有相同MRE，則不能發生調控。StarBase數據庫提示lncRNA UCA1、mRNA G6PD分別與miRNA miR-1具有共同的MRE（見圖6），為通過網絡篩選調控軸提供了生物學依據。

圖6 冠心病血瘀證ceRNA網絡MRE驗證

3 討論

中醫證候宜使用復雜系統方法學探究其生物學基礎，現有研究在質量和數量上均無法滿足需求，其方法也尚未形成體系[26]。構建ceRNA網絡，以模塊藥理學的方式挖掘證候的生物學基礎是分析病證結合機制的新方法之一，目前已有多項研究通過構建無向的共表達網絡[27]或有向的基因調控網絡[28]、蛋白相互作用網絡[29]等探討證候與疾病的共同生物學機制，但基于構建的整體網絡進行分析，難以直接找到其中的關鍵靶點及調控關系。模塊藥理學認為，復雜疾病的研究需要一種模塊化的靶點研究模式，強調對復雜生物網絡進行模塊化分析，用于度量和整合藥物干預網絡的特征。其中，靶點-靶點相互作用及動態平衡規律不僅是影響模塊化功能的關鍵結構因素，也是疾病影響因素擾動的體現[30]。本研究在探討冠心病血瘀證生物學基礎過程中，考慮到lncRNA能夠直接作用于mRNA，補充了lncRNA與mRNA之間的相互作用關系，不僅豐富了ceRNA網絡，且使網絡結構在空間上更加穩定；對ceRNA網絡進行功能模塊劃分，依據熵值法篩選模塊劃分的最佳方法，確保網絡的有序性和功能性；利用功能模塊篩選出潛在調控軸，能夠基于已有的數據庫實驗數據快速篩選關鍵靶點及靶點之間的作用關系，為開展證候生物學機制研究提供新思路。

模塊6涉及 的lncRNA UCA1、miRNA miR-1、mRNA G6PD臨床報道較多。miR-1在心肌梗死患者中的表達水平顯著高于非心肌梗死患者，在急性胸痛發作3 h內具有診斷價值，是心肌梗死預后的獨立危險因素，此外還參與心肌缺血再灌注損傷的治療過程中[31-32]。UCA1（尿路上皮癌相關蛋白1）能夠通過MAPK通路減少心肌梗死患者由于缺血缺氧引起的細胞凋亡和損傷，在成年人心臟中特異性表達，心肌梗死患者中表達量顯著降低[22-23，33]。G6PD參與冠狀動脈和肺動脈收縮和舒張的調節，在冠心病中表達水平顯著降低[34]，且能作為冠心病診斷的關鍵基因[35]。三者之間存在密切的調節關系：G6PD抑制或敲低時，血管平滑肌細胞限制性收縮蛋白、心肌蛋白及miR-1的表達增加[24]。miR-1能夠通過抗氧化網絡的轉錄后修飾加重心臟氧化應激，其過表達時能夠表現出較高的心肌細胞活性氧水平和對H2O2誘導的氧化應激的較低抵抗力，證實G6PD是miR-1轉錄后抑制的新型靶標[25]。

冠心病血瘀證ceRNA網絡富集分析得到多條通路，如PI3K-Akt信號通路、ErbB信號通路、GnRH信號通路、P53信號通路、MAPK信號通路、雌激素信號通路等。活化的PI3K-Akt途徑中，PI3K和Akt表達及磷酸化水平顯著提高，可抑制磷酸酶和張力蛋白同源物對血管平滑肌細胞存活的抑制作用，使細胞增殖率增加，細胞凋亡水平降低，從而保護心肌細胞[36]。miRNA-26a-5p能夠通過靶向PTEN激活PI3K-Akt通路，影響內皮細胞的增殖和凋亡[37]。動脈粥樣硬化中上皮脂肪組織p53表達水平較高，能夠通過mRNA和蛋白水平觀察到Sirt-1和p53之間存在負相關，Sirt1-p53軸可能通過促進細胞凋亡參與動脈粥樣硬化[38]。

除相關通路外，KEGG還富集到18條癌癥相關通路，占富集通路總數的29%，考慮可能由于冠狀動脈疾病和癌癥通常通過共同的生物學途徑和危險因素在同一患者體內發生[39]，此外，也有通過生物信息學方式探討乳腺癌與冠心病共享生物標志物的篩選，發現NLN、POSTN、MAPT、MYO6、MAP1B、FBXO31、KIT、PIK3R等18個mRNA可作為檢測乳腺癌誘導冠心病的潛在標志物。模塊1中的PVT1是新發現的致癌因子，參與胃癌、膽囊癌等多種癌癥的發生過程，同時也能通過miR-128-3p-SP1-TGF-β1-Smad軸促進心房纖維化[40]。模塊2中的H19在正常動脈中檢測不到，但在損傷的血管和動脈粥樣硬化病變后的內膜中高度表達[41]，高表達H19會促進肝癌細胞的增殖，下調會抑制腫瘤細胞增殖[42]。同樣，模塊6中的UCA1不僅參與到UCA1-miR-1-G6PD軸，也能夠通過miR-143/MYO6軸促進大腸癌的發生，且UCA1還能作為結直腸癌的治療靶標[43]。

ceRNA調控理論代表了廣泛的基因表達轉錄后的調控模式，篩選冠心病血瘀證相關lncRNA、miRNA、mRNA，構建基因間調控網絡，從轉錄組學機制層面研究冠心病血瘀證物質基礎和病理機制，可為中醫證型相關研究提供一定的科學基礎。功能模塊識別很好地解決了生物網絡過于復雜難以分析的問題。通過構建網絡，能夠更高效整合人體和疾病生物分子層面的數據，從空間結構層面找到關鍵調控節點，有助于闡釋疾病發生的機制，預測疾病的發生與發展，為早篩早檢早治療提供可能。本研究在構建冠心病血瘀證相關ceRNA網絡時，補充了lncRNA與mRNA之間的聯系，并通過模塊藥理學理論劃分模塊，從模塊中篩選潛在lncRNA-miRNA-mRNA調控軸，可在一定程度上為挖掘冠心病血瘀證潛在的生物學基礎提供重要參考。