基于熒光PCR技術構建MGMT基因甲基化定性檢測方法

康燦昆

（廈門飛朔生物技術有限公司，福建 廈門 361100）

神經膠質瘤是最常見的原發性惡性中樞神經系統腫瘤，年發病率為（5 ～ 8）/10萬，5年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌[1]。目前，膠質瘤的治療方案主要是手術聯合放化療等綜合治療；其中，最具代表性的化療藥物是替莫唑胺[2]。替莫唑胺能在人體內迅速轉化為活性產物MTIC，使腫瘤細胞DNA烷基化，從而引起細胞毒性損傷[3]。

MGMT基因編碼的O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶是一種DNA修復酶，可以將O6-甲基鳥嘌呤的甲基轉移至自身的半胱氨酸殘基上，修復細胞毒性損傷，從而提高腫瘤細胞對烷化劑的抗性[4]。因此，MGMT基因甲基化的膠質母細胞瘤患者能夠受益于替莫唑胺治療[4]；同時，MGMT基因甲基化狀態也是一個獨立的預后指標，MGMT基因甲基化的神經膠質瘤患者治療的近期客觀療效和無進展生存期明顯優于未甲基化的患者[5]。

該研究以MGMT基因為靶標，利用高通量測序技術的優點，明確樣本的亞硫酸氫鹽轉化效率和目標片段上每個CpG位點的甲基化水平，基于此構建MGMT基因甲基化熒光PCR定性檢測方法，為MGMT基因甲基化研究提供一種新的研究思路。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

用于試驗研究的41例神經膠質瘤樣本由廈門飛朔生物醫學檢驗實驗室捐贈。

1.2 試劑和儀器

試驗所用試劑和儀器如下：QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（德國Qiagen）、EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit（德國Qiagen）、基因測序用文庫試劑盒（廈門飛朔）、MiSeq Reagent Kit v2（300-cycles）（Illumina）、全自動醫用PCR分析儀SLAN-96S（上海宏石）以及基因測序儀MiSeq（Illumina）。

1.3 DNA提取

使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit從神經膠質瘤石蠟包埋組織樣本中提取基因組DNA，通過微量分光光度計測定樣本的濃度和純度，要求樣本濃度大于25 ng/μL，OD260/OD280值應為1.7～2.2。

1.4 亞硫酸氫鹽修飾

根據EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit說明書的要求對樣本進行亞硫酸氫鹽修飾轉化，樣本投入量為500 ng～1 000 ng，洗脫體積為20 μL。

1.5 文庫構建

MGMT基因存在1個CpG島（hg19：chr10：131264949～131265710），包括75個CpG位點。以Malley D S等人[6]定義的甲基化關鍵區域DMR2為靶向區間，設計擴增引物（表1）。直接取5 μL修飾后的產物，按照基因測序用文庫試劑盒說明書步驟構建測序文庫。

表1 MGMT擴增引物

1.6 高通量測序

使用毛細管電泳儀進行文庫片段質控，文庫主要片段大約分布在350 bp；使用Qubit 4.0進行文庫濃度質控，濃度應不低于1 ng/μL。將文庫稀釋至4 nM后等比例混合變性，使用MiSeq Reagent Kit v2（300-cycles）上機檢測。

1.7 測序結果分析

將靶向區間內所有C堿基替換成T堿基，以此構成一個模擬基因組。使用Flash軟件（v1.2.11）對雙端測序結果進行合并得到新的FASTQ文件，并通過BWA軟件（v0.7.17）和Samtools軟件（v1.9）進行比對、建立索引，得到BAM文件。

統計靶向區間內所有非CpG位點的C堿基轉換成T堿基的頻率，取平均值得到樣本的亞硫酸氫鹽轉化效率P。再分別統計靶向區間內CpG位點的C堿基轉換成T堿基的頻率PN，P-PN即為CpG位點甲基化水平。

1.8 熒光PCR檢測

根據高通量測序結果挑選特異性CpG位點設計引物探針，研發基于熒光PCR技術的人類MGMT基因甲基化檢測試劑盒。用無核酸酶水將修飾后的樣本稀釋至5 ng/μL，取5 μL的稀釋后樣本、對照品進行擴增檢測。

1.9 統計學分析

使用Heml軟件（v1.0）對CpG位點的甲基化水平（百分比數據）進行聚類分析。聚類相似度計算方法選擇Average Linkage和Euclidean Distance。

用SPSS軟件（v21.0）進行統計學分析，將不同的ΔCt值作為分界點，以靈敏度為縱坐標、1-特異性為橫坐標，繪制ROC曲線。

2 結果

2.1 高通量測序結果

以MGMT基因甲基化關鍵區域DMR2為靶標設計了1對擴增引物，覆蓋MGMT基因第41號～75號CpG位點，其擴增產物大小為258 bp。當測序文庫使用MiSeq Reagent Kit v2（300-cycles）上機檢測時，無法對258 bp的測序片段進行雙向測通。因此，當分析測序結果時，需要用雙端測序結果進行數據拼接，以得到片段的完整序列信息。

利用高通量測序平臺的技術優勢排除CpG位點甲基化的干擾，計算靶向區間內所有非CpG位點的C堿基轉換成T堿基的頻率，取平均值得到41例樣本的亞硫酸氫鹽轉化效率（圖1）。所有樣本的轉化效率均大于99%，平均轉化效率達到99.65%，排除修飾不完全干擾的可能性。

圖1 亞硫酸氫鹽轉化效率匯總

分析高通量測序結果，統計41例樣本中每個CpG位點的甲基化水平，使用Heml軟件（v1.0）進行雙向聚類分析（圖2）。將41例樣本分成3組，組1中所有CpG位點的平均甲基化水平小于1.5%，普遍缺乏甲基化。組3中所有CpG位點的平均甲基化水平大于5%，存在大量甲基化水平大于10%的CpG位點，顯示高水平的甲基化。組2處于中間區域，其大部分CpG位點的甲基化水平小于5%。27個CpG位點可以聚類成4組，其中組2（圖2中用虛線標示）包括第58號～64號、第66號共8個連續的CpG位點，其甲基化程度高于其他分組，各CpG位點的甲基化水平均一性好、關聯性強。因此，選擇第58號～64號、第66號CpG位點設計引物探針，研發基于熒光PCR技術的甲基化檢測試劑盒。

圖2 MGMT基因第41號～75號CpG位點的甲基化水平聚類分析熱圖

2.2 熒光PCR檢測結果

使用熒光PCR檢測試劑盒對41例樣本進行檢測，匯總2個通道的Ct值結果，當FAM通道無擴增曲線時，以最大循環數30計算，并用FAM通道的Ct值減去HEX通道的Ct值，得到ΔCt值。取第58號～64號、第66號CpG位點的甲基化水平平均值作為樣本的平均甲基化水平。以ΔCt值為縱軸、平均甲基化水平（百分比數據）為橫軸繪制散點圖（圖3）。以平均甲基化水平5%為閾值線，ΔCt值為判讀指標，利用ROC曲線法確定該試劑盒的ΔCtCut-off值為8，當樣本FAM通道無擴增曲線或ΔCt值≥8時，判讀為甲基化陰性或低于試劑盒檢測下限；當ΔCt值＜8時，判讀為甲基化陽性。

圖3 MGMT基因甲基化熒光PCR檢測結果分析

3 討論

MGMT蛋白的O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶活性是神經膠質瘤細胞對烷化劑產生抗性的直接因素，與MGMT基因mRNA或者MGMT蛋白的表達水平相比，甲基化狀態更能反映患者使用化療藥物輔助治療的受益情況[7]。因此，當無法直接確定腫瘤樣本中MGMT蛋白的活性時，首選以MGMT基因甲基化狀態作為間接評價指標。

當前，甲基化特異性PCR技術（MSP）和焦磷酸測序技術是神經膠質瘤MGMT基因甲基化狀態評估的常用方法。甲基化特異性PCR技術使用特異性引物進行PCR擴增，以電泳條帶的有無進行判讀。在特異性引物的設計過程中，CpG位點的選擇至關重要，關系著樣本的檢測結果。以Esteller和Felsberg等人發表的引物組合對80例神經膠質瘤樣本進行檢測時發現，結果一致性僅為72.5%（58/80）[8]。焦磷酸測序是一種新型酶聯級化學發光測序技術，可以同時分析多個CpG位點的甲基化水平，再以甲基化平均水平進行判讀。在臨床研究中，常以總生存期或無進展生存期為指標劃定閾值線，不同方案劃定的閾值各不相同。

為了克服以上2種技術的弊端，該研究采用高通量測序技術分析41例神經膠質瘤樣本的亞硫酸氫鹽轉化效率以及MGMT基因第41號～75號CpG位點的甲基化水平。試驗結果顯示，樣本的基因組DNA平均轉化效率達到99.65%。對CpG位點的甲基化水平進行雙向聚類分析，篩選第58號～64號、第66號CpG位點區域用于研發基于熒光PCR技術的甲基化檢測試劑盒。

熒光PCR檢測試劑盒以ΔCt值為判讀指標，ΔCtCut-off值為8。以平均甲基化水平5%為閾值線，采用高通量測序和熒光PCR技術分別對41例樣本的甲基化水平進行檢測，對比結果后發現，有40例樣本的檢測結果完全一致。

4 結語

該研究基于高通量測序技術對目標片段上每個CpG位點的甲基化水平進行聚類分析，成功構建了MGMT基因甲基化熒光PCR定性檢測方法，其與高通量測序方法檢測結果有較高的一致性，而且具有操作簡便、成本低以及效率高的優勢，適用于臨床MGMT基因甲基化狀態常規化檢測，可以為個體化治療提供指導。