一起豬2型鏈球菌的分離鑒定及診療

黃中善 黃文炳 梁家綏

（1.南寧市賓陽縣動物疫病預防控制中心，廣西 南寧 530400；2. 廣西悅牧生物科技有限公司，廣西 南寧 530007）

鏈球菌（Streptococcus）是重要的人畜共患傳染病病原菌，可感染人以及豬、牛、羊等多種動物，其主要傳播方式為經口、呼吸道及破損的皮膚傷口感染，也可垂直傳播。［1］鏈球菌屬球菌科、鏈球菌屬、革蘭氏陽性兼性厭氧菌。豬鏈球菌（Streptococcus suis）對各種品種豬群、不同年齡及性別的豬均易感，可引起腦膜炎、關節炎、敗血癥、多發性漿膜炎、肺炎和急性死亡等［2，3］，是世界范圍內養豬業最常見的細菌性疾病之一，危害著生豬養殖業的健康發展。更為重要的是，豬鏈球菌能夠通過傷口或豬產品感染人，引起人腦膜炎、敗血癥等重要的疾病［4］，對相關從業人員的身體健康和公共衛生構成嚴重威脅。

目前，根據鏈球菌莢膜多糖抗原的差異，可將其分為35個血清型，即1~34及1/2型。［5］對豬具有較強致病性的主要血清型有1型、2型、7型和9型，其中血清2型致病力最強［6］，危害最為突出。本試驗采集廣西賓陽縣某規模化豬場2021年6月發生的疑似豬鏈球菌的組織病料，通過細菌分離、生化鑒定、PCR診斷及藥敏試驗，鑒定為血清2型豬鏈球菌，為2型豬鏈球菌的診斷與治療提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發病情況及病料采集

2021年5月18日廣西賓陽縣某規模化豬場外購963頭體重15 kg左右的保育豬苗回來飼養，至5月31日起陸續出現豬只突然倒地、四肢劃水及急性死亡的病情，每天死亡2~3頭豬；用藥可以暫時控制病情，停藥后又出現反彈。6月11日解剖并采集了2頭病死豬的肺臟、脾臟、腎臟、腦組織及淋巴結等組織器官分別進行細菌分離鑒定。

1.1.2 主要試劑

普通營養肉湯，胰蛋白大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白大豆肉湯（TSB）均購自北京陸橋技術股份有限公司；DNA提取試劑盒以及PCR相關試劑、DNA Ladder Marker等均購自天根生化科技（北京）有限公司；微生物微量生化鑒定管和抗生素藥敏紙片均購自于杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染液試劑盒為珠海貝索生物技術有限公司產品；其他常規試劑均為分析純；相關引物由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 病原分離純化

無菌操作采集的肺臟、脾臟、腎臟、腦和淋巴結等病料分別劃線接種于TSA平板（含5%的新生牛血清），置于37℃培養箱中培養過夜，觀察菌落生長形態特征，挑選形態一致的優勢菌落進行革蘭氏染色、鏡檢及挑單菌落進一步分離純化。

1.2.2 生化試驗

按生化試驗的說明書進行操作，將分離純化的菌株分別接種于甘露醇、甘露糖、棉籽糖、山露醇、阿拉伯糖、山梨醇、水楊素、β半乳糖苷、馬尿酸鹽、松三糖、乳糖、核糖、七葉苷、精氨酸雙水解酶和精氨酸脫羥酶等細菌生化反應管，依據伯杰細菌鑒定手冊對各生化反應結果進行判定。［7］

1.2.3 血清型的PCR鑒定檢測

用分離純化的細菌提取的基因組DNA做為模板，參照文獻［8］根據豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖基因的特異性設計引物，分別用于豬鏈球菌血清1、2、7和9型的鑒定（表1）。PCR擴增反應為25 μL體系，分別為2×PCR pre-Mix 12.5 μL、ddH2O 9.0 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2.5 μL。PCR反應條件為95℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 50 s，35個循環；72℃ 10 min；最后4℃保存。PCR反應結束后，取10 μL PCR擴增產物于1%的瓊脂糖凝膠進行電泳并觀察記錄結果。

表1 豬鏈球菌血清1、2、7、9型鑒定的引物

1.2.4 藥物敏感性試驗

選取紅霉素、氟苯尼考、阿莫西林、多黏菌素B、恩諾沙星、環丙沙星、林可霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、卡那霉素等28種常用藥物對分離純化的細菌進行藥敏試驗，參照文獻采用瓊脂擴散法（K-B法）進行。

1.3 綜合防治措施

根據豬場發病特征、實驗室診斷的結果以及豬場用藥時能夠控制病情而停藥后出現反彈的實際情況，建議豬場主要用豬鏈球菌滅活疫苗進行緊急免疫，同時再用敏感藥物進行控制。

2 結果

2.1 細菌分離純化及形態特征

將組織病料接種的TSA平板置37℃溫箱，經過夜培養后，發現其中一頭病死豬的肺臟、淋巴結和腦組織接種的平板均有細菌生長；而另外一頭豬的肺、脾、腎和淋巴結也能培養出細菌，但腦組織沒分離出細菌，送檢病料樣品各器官細菌分離結果如表2所示。在TSA平板上均可觀察到形態一致，針尖大小、灰白透明、表面光滑的近圓形的菌落。

表2 送檢病料樣品各器官細菌分離結果

挑取單菌落涂片后進行革蘭氏染色，鏡檢為G+菌，且以多個圓形或卵圓形組成的短鏈形式存在，符合豬鏈球菌的形態特征，具體鏡檢形態特征如圖1所示。

圖1 分離菌株革蘭氏染色鏡檢形態特征

2.2 生化特性的鑒定

取分離純化后菌株開展各種生化試驗檢測。分離菌株的生理生化特征如表3所示，結果顯示，分離菌株糖、醇發酵能力以及各種生化試驗的鑒定結果與豬鏈球菌的生化特性完全相符。

表3 分離菌株的生理生化特征

2.3 豬鏈球菌的分型鑒定

用豬鏈球菌的特異性分型引物來進行PCR擴增鑒定。PCR鑒定結果如圖2所示，結果顯示，豬鏈球菌血清1、7和9型的特異性引物均未擴出目的條帶，而豬鏈球菌血清2型的引物擴增出450 bp的特異性目的條帶，表明該分離株為豬鏈球菌血清 2型。

圖2 豬鏈球菌血清1型、2型、7型、9型的PCR鑒定結果

2.4 藥物敏感性試驗結果

采用常用28種抗生素對分離菌株進行藥物敏感性測定，結果詳見表4。藥敏試驗結果顯示，該鏈球菌對頭孢哌酮、頭孢克肟、頭孢噻肟、米諾環素、萬古霉素、壯觀霉素6種藥物高度敏感；對頭孢西丁、頭孢拉定、頭孢呋辛、紅霉素、強力霉素、阿奇霉素、亞胺培南、氟苯尼考、阿莫西林、多黏菌素B、呋喃妥因11種藥物中度敏感；對鏈霉素、苯唑西林、氨曲南、左氟沙星、卡那霉素、恩諾沙星、環丙沙星、林可霉素、青霉素、氧氟沙星、泰樂菌素11種藥物低度敏感或者耐藥。

表4 分離菌株的藥物敏感性結果 單位：mm

2.5 防控效果反饋

從5月31日豬場發生鏈球菌病例以來，至6月13日累計死亡28頭豬。6月14日采取豬鏈球菌滅活疫苗的緊急免疫，同時用敏感藥物進行控制，隨后4天總共死亡3頭，第5天之后就沒有再出現鏈球菌病例，病情得到了完全控制。

3 討論

豬鏈球菌是危害養豬業的重要病原菌之一，世界上幾乎所有養豬國家都廣泛存在該菌。豬鏈球菌血清型眾多，以血清2型危害最為嚴重。1990年在我國廣東省豬群中首次發現血清2型豬鏈球菌［9］，歷史上我國出現過2次由2型豬鏈球菌感染引起人死亡的事件。其一是1998年江蘇省豬場暴發的急性敗血型豬鏈球菌血清2型疫情，造成14人死亡［10］；其二是2005年夏天豬鏈球菌血清2型疫情在四川再次暴發，疫情殃及養豬從業者及生豬屠宰人員等，造成38人死亡，引起了世界范圍內的高度關注。［11］除血清2型豬鏈球菌以外，血清1、7和9型等也是常見的引起豬感染發病的重要血清型，備受獸醫工作者的重視。

豬鏈球菌病在臨床上表現主要分為關節炎型、敗血癥型、腦膜炎型三種［12］。腦膜炎型通常表現為豬只突然倒地、站立不起、四肢劃水、眼瞼腫大和眼球突出的發病特征，及早發現及早救治的豬只一般能夠康復，若發病超過2小時沒有采取治療措施，基本上以死亡告終。本試驗從疑似豬鏈球菌感染的患病死亡豬體內分離到病原菌，經形態學和生化鑒定確定該菌株為鏈球菌，結合臨床發病癥狀，初步判斷為本次疫情為腦膜炎型鏈球菌病。由于鏈球菌莢膜多糖抗原性是確定其血清型的重要依據，基于莢膜多糖抗原基因的差異設計血清型特異引物可以對鏈球菌分離菌株進行精確的鑒定。王花茹［13］等建立的主要致病血清型多重PCR檢測方法對豬鏈球菌血清1型、2型、1/2型、7型、9型、14型等6種主要致病血清型檢出率可達100%。本試驗中通過特異性的PCR引物對莢膜多糖基因進行檢測，確定所分離的菌株為豬鏈球菌血清2型，為科學精準的制定防控措施提供了重要依據。

為能夠提供可靠的治療方法，本試驗對分離菌株進行藥敏測定。從藥敏試驗結果來看，分離菌株對鏈霉素等11種藥物低度敏感或者耐藥，對頭孢西丁等11種藥物中度敏感，對頭孢哌酮等6種藥物高度敏感。由于豬場投藥能夠較好的控制病情，但停藥后病情反彈，結合臨床治療經驗，建議其配合采取疫苗免疫的策略。據豬場主反饋，在緊急免疫豬鏈球菌滅活疫苗5天后，就沒有再出現腦膜炎型鏈球菌的病例，收到了良好的防控效果。