內皮細胞能量代謝與病理性血管生成

李 洋，周媛媛，夏思偉，陳 利，楊 婷，張 峰，鄭仕中

(南京中醫藥大學江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

1 血管生成概述

血管是生物運送血液的管道，在為機體提供氧氣和營養的同時，也為免疫監視提供通道。血管遍布所有組織器官，其結構或功能性血管異常將會引發多種疾病。血管維持或生長不足會導致神經退行性疾病、心肌梗死或局部缺血性疾病，血管的過度生長或結構異常也會導致許多疾病的發生，包括癌癥、炎癥性疾病和動脈高壓等[1]。近年來，血管生成越來越多地被描述為原始血管網生長和再塑形成復雜網絡的過程，該過程包括基底膜被蛋白溶解，細胞外基質的蛋白水解、內皮細胞遷移和增殖、細胞外基質的產生、血管管腔形成以及新生血管吻合成網等關鍵步驟[2]。其復雜的形成過程導致血管的形成與發展易受多種因素的影響，包括促血管生成因子：血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素(angiopoietins)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、轉化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)等[3]，血管生成抑制因子如內皮抑素、血管抑制素和TNP-470(煙曲霉素的類似物，一種抗血管生成藥物)等，除此外還包括炎癥因子、內皮代謝[4]等。內皮代謝在血管生成中的作用舉足輕重，內皮細胞(endothelial cells，ECs)需協調細胞新陳代謝，使代謝通量適應分支血管不斷增加的能量和生物量需求[4]。因此，從內皮能量代謝入手尋找病理性血管生成的解決方法具有重要意義。

2 內皮代謝與病理性血管生成

2.1 內皮糖代謝與病理性血管生成ECs單層覆蓋于血管內壁上，是血流和周圍組織間營養和氧氣交換所必需的。在病理性血管生成的刺激反應中，內皮細胞將從靜止狀態迅速轉變為增殖和遷移狀態，而內皮細胞獨特的糖酵解特性對細胞增殖、遷移和對環境變化的反應至關重要[5]。糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)是內皮細胞的兩個主要能量產生途徑，但通常情況下，在血管新生期間，約85%的三磷酸腺苷(ATP)是通過人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的糖酵解途徑產生的[6]。與無氧糖酵解(即在缺氧下發生的糖酵解)不同，有氧糖酵解可繞過線粒體OXPHOS，促進葡萄糖水解速率的增加，加快供能速率，因此病理性的血管生成更依賴于有氧糖酵解提供能量。

有氧糖酵解產生的丙酮酸可以通過介導VEGF和纖溶酶原激活物抑制劑-1在肝癌細胞中的轉錄來誘導缺氧誘導因子-1α的表達并加速血管生成過程[7]。丙酮酸激酶M2(PKM2)是調節有氧糖酵解最后一步的關鍵酶，Ren等[8]通過管形成試驗、傷口愈合試驗、細胞侵襲實驗發現評估PKM2對血管生成的作用，并通過蛋白質印跡分析、流式細胞術、線粒體膜電位檢測、活性氧檢測、免疫熒光染色和定量實時聚合酶鏈反應來研究PKM2調節血管駐留內皮祖細胞血管生成的潛在機制，發現PKM2的激活可以通過調節糖酵解、線粒體裂變和融合來促進血管駐留內皮祖細胞的增殖和血管生成分化。Den等[9]通過IHC染色檢測皮下腫瘤中Dickkopf相關蛋白2(DKK2)和內皮轉錄因子的表達，發現內皮轉錄因子和微血管的形成與DKK2的表達呈正相關，進一步研究發現DKK2通過有氧糖酵解從葡萄糖中產生乳酸并在腫瘤微環境中積累，并且可以與葡萄糖攝取所需的脂蛋白受體相關蛋白6協同作用，激活下游的mTOR信號通路，進一步加速乳酸分泌，而乳酸作為DDK2的最終執行者刺激內皮細胞的管形成從而促進腫瘤的血管生成。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶(PFKFB3)是內皮細胞糖酵解的關鍵酶，其能夠對ECs的多種細胞發生過程產生影響并最終影響血管生成：PFKFB3能夠更快地產生ECs增殖所需的能量并促進葡萄糖的吸收，從而為血管的發芽行為實現更多的能量產生；高水平的核PFKFB3促進ECs的生長，對維持ECs的細胞狀態具有重要的幫助作用；PFKFB3的沉默會降低糖酵解通量，損害尖端細胞的競爭力和莖細胞增殖，ECs中絲狀偽足和片狀偽足的形成也會受到損傷等[10]。

許多藥物治療血管生成相關疾病的機制也與有氧糖酵解緊密相關。白藜蘆醇通過調節ERK介導的PKM2核易位降低葡萄糖轉運蛋白1、磷酸果糖激酶-1、己糖激酶2和PKM2等有氧糖酵解關鍵酶活性來抑制人內皮細胞的血管生成[11]。斑蝥素通過降低細胞外酸化率，增加高轉移細胞的耗氧率抑制有氧糖酵解，從而顯著抑制了血管生成的侵襲[12]。以上結果均表明，有氧糖酵解在病理性血管生成發生、發展中扮演重要角色，并且通過藥理學手段削弱有氧糖酵解過程相關因子的表達，對血管生成相關疾病起到明顯的治療作用。因此，進一步以有氧糖酵解為切入點探究病理性血管生成治療藥物具有重要意義。

2.2 內皮氨基酸代謝與病理性血管生成內皮細胞的代謝被認為是血管生成的驅動力，盡管有氧糖酵解在血管生成過程中至關重要，但它不是唯一的代謝決定因素，最近的研究表明，除了糖酵解和脂肪酸氧化外，內皮細胞還依賴特定的氨基酸來增殖、遷移和存活，因此氨基酸代謝在調節和維持血管功能方面也發揮著重要作用[13]。高水平的不對稱二甲基精氨酸(ADMA)是損害血管生成的重要因素。據報道，小鼠體內ADMA的缺乏強烈誘導了血管生成，而心肌營養素-1的過度表達對ADMA的抑制導致內皮細胞遷移和增殖以及血管形成的增加[14]。羥脯氨酸是動物體內結構和生理上重要的亞氨基酸，其轉化生成的甘氨酸除了促進谷胱甘肽、DNA、血紅素和蛋白質的產生外，還能夠抑制血管內皮生長因子介導的內皮細胞增殖，對血管生成產生負面作用[13，15]。L型氨基酸轉運蛋白1(LAT1)介導的氨基酸轉運是支持體外內皮細胞增殖和翻譯起始的基礎，Quan等[16]在小鼠腫瘤模型中觀察到高內皮LAT1表達。通過廢除LAT1的功能或抑制其表達后發現體內外的血管生成受到抑制。此外，LAT1是VEGF-A依賴性遷移、侵襲、管形成所必需的，這表明內皮細胞中促血管生成信號傳導和能量代謝之間存在交互作用。

谷氨酰胺(glutamine，Gln)代謝在血管生成中的作用更加豐富。Gln提供ECs的三羧酸循環中的大部分碳，并通過還原羧化作用促進脂質生物合成。Kim等[17]發現，在細胞培養中，Gln剝奪或谷氨酰胺酶的抑制會阻止ECs增殖，谷氨酰胺酶在小鼠EC中的特異性缺失顯著減弱了血管生成。由基因 GLUL編碼的谷氨酰胺合成酶是一種將谷氨酸和氨轉化為谷氨酰胺的酶，它由內皮細胞表達。Eelen等[18]在小鼠中發現，內皮細胞中Glul的基因缺失會損害血管發育過程中的血管萌發，而谷氨酰胺合成酶的藥理學阻斷抑制眼部和炎癥性皮膚病中的血管生成。Gln是內皮細胞消耗最多的一種氨基酸，內皮細胞通過Gln產生的谷胱甘肽(glutathione，GSH)用于氧化還原穩態，Gln的耗竭使內皮細胞容易受到活性氧誘導的損傷，以川芎嗪-樺木酸衍生物(BA-12)為例。Cui等[19]基于UPLC-QTOF-MS的靶向代謝組學和藥理學實驗，檢測了GSH代謝相關指標以驗證BA-12治療血管生成的主要機制，發現檢測樣品中γ-谷氨酰轉移酶、谷胱甘肽還原酶和磷脂酶A2的活性顯著升高，而γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性沒有顯著變化，表明BA-12導致GSH代謝的激活，過氧化產物的增加和抗氧化指標的顯著降低表明氧化還原平衡受到進一步影響，二者共同導致了血管生成的抑制。Gln分解代謝產生的谷氨酸可以轉化為鳥氨酸，產生促血管生成因子，如一氧化氮和多胺[20]。谷氨酰胺缺失或抑制谷氨酰胺合成酶會由于增殖和遷移受損而導致血管發芽缺陷，減少病理性血管生成[21]。

2.3 內皮脂質代謝與病理性血管生成越來越多的證據表明內皮功能障礙與脂質代謝異常之間存在密切關系。Liang等[22]發現人微血管內皮細胞暴露于重金屬鎘(Cd)24 h后，內皮功能嚴重受損并最終導致了細胞的死亡。鎘暴露通過破壞人微血管內皮細胞中的脂質代謝導致內皮功能障礙，具體表現為Cd加速了甘油三酯的分解并導致游離脂肪酸的積累，脂肪酸氧化受損進一步誘導了活性氧的產生和線粒體功能障礙，并最終導致了細胞死亡。脂質過載與影響細胞信號活動和內皮功能的內皮表觀遺傳狀態的變化密切相關。Chen等[23]通過高脂飲食誘導小鼠脂質超負荷狀態，發現與喂食正常食物的小鼠相比，高脂飲食誘導的肥胖小鼠表現出血管生成缺陷，具體表現為后肢缺血后血流恢復速度較慢、皮膚損傷后傷口愈合速度降低以及受傷的組織中毛細血管密度下降等。而通過過表達激活轉錄因子4增加了其與甲硫氨酸腺苷轉移酶2A的結合，誘導賴氨酸甲基轉移酶2A恢復因脂質過載導致的NOS3和ERK1基因調控區的H3K4甲基化水平的降低和血管生成信號的活性，改善了鈍化的血管生成反應。以上結果表明，脂質過載環境導致內皮細胞相關血管生成信號的表觀遺傳狀態改變，這為具有脂質超負荷的疾病如肥胖和糖尿病的血管并發癥具有重要的潛在治療意義。

由膽堿-乙醇胺磷酸轉移酶1(CEPT1)介導的從頭磷脂生成對于肝臟中過氧化物酶體增殖物激活受體α (peroxisome proliferators-activated receptor α,PPARα)等轉錄因子的磷脂激活至關重要。Zayed等[24]通過誘導VE-鈣粘蛋白-他莫昔芬誘導型Cre重組酶介導的重組(Cept1Lp/LpCre+)構建了特異性缺失CEPT1的ECs，發現CEPT1的特異性缺失降低了ECs增殖、遷移和小管形成，且Cept1Lp/LpCre+小鼠缺血后肢的灌注和血管生成減少。其中機制包括CEPT1影響ECs中的PPARα磷酸化，PARα激動劑非諾貝特可以在Cept1減少的情況下挽救ECs功能、后肢灌注和PPARα激活表達證明了這一點。以上實驗結果表明，參與磷脂生成的病理代謝途徑在ECs功能和缺血性損傷后的恢復中發揮重要作用。

內皮細胞脂肪酸代謝也是影響病理性血管生成的代謝過程的重要部分。內皮細胞對脂肪酸代謝的利用與其他細胞不同，它需要從血液中被動擴散或運輸脂肪酸進入細胞進行脂肪酸氧化[25]。攝取脂肪酸是細胞利用脂肪酸的第一步，也是代謝調節的關鍵節點[26]。在細胞內，非游離脂肪酸需與脂肪酸結合蛋白結合才能被轉運至目的地。脂肪酸結合蛋白4(fatty acid-binding protein 4, FABP4)是一種脂肪酸分子伴侶，在體內沉默FABP4后觀察到了微血管密度的顯著下降，機制研究發現FABP4的沉默抑制內皮芽體外伸長，VEGF和DLL4-Notch1信號通路的相互作用被擾亂，導致血管萌發和血管生成的減少[27]。肉堿棕櫚酰轉移酶1A(CPT1A)是脂肪酸代謝途徑的限速酶，CPT1A的內皮損失通過增加內皮氧化應激促進EC功能障礙，Shi等[28]發現，對CPT1A進行藥物阻斷會損害中藥丹氣丸的促血管生成作用，證明了FAO在血管生成過程中發揮的關鍵作用。另外，ECs中的脂肪酸合酶缺失會引起丙二酰輔酶A水平升高，導致在賴氨酸1218處的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)丙二酰化，降低mTOR復合物1的活性，mTOR相關通路受阻，ECs增殖和血管發芽受到抑制，導致體內血管生成受到損害，且脂肪酸合酶阻斷劑可減少病理性眼部新生血管形成[29]。IL-17A是調節腫瘤進展的關鍵細胞因子，Wang等[30]通過植入轉染IL-17A表達載體或對照載體的人肺癌細胞株H460建立異種移植模型，觀察IL-17A對HUVECs出芽和管腔形成的影響，發現IL-17A在體內和體外激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路促進FAO，增加內皮細胞的線粒體呼吸刺激H460腫瘤生長和新血管生成。

3 結語與展望

內皮細胞代謝是血管生成的關鍵調節因素，也是血管生成相關疾病的有效治療靶點。在這里，我們列舉和描述不同的代謝途徑通過影響內皮細胞的功能進而對病理性血管生成進程起到決定性作用。事實上，內皮代謝遠非簡單地刺激細胞生長和遷移的教條觀點，復雜的疾病環境對內皮細胞的影響是多層次的，不同血管床中EC具有異質性，轉化為功能和表型的差異，因此來自不同組織的ECs的代謝不可一概而論，且內皮細胞的代謝也會通過細胞間通訊對其他細胞的正常功能產生影響。因此需要幾種代謝途徑與生長因子、遺傳信號平行作用，以維持內皮細胞正常生物學行為。當內皮代謝紊亂使內皮細胞功能失調，并導致嚴重疾病時，這一概念變得更加重要。隨著內皮糖酵解和脂肪酸代謝過程被開創性地轉化為這些疾病的可能治療途徑，其他代謝途徑在血管生成中作用的研究也逐漸引起了研究人員的關注。深入研究內皮代謝不僅能夠為研發抗病理性血管新生的藥物提供強有力的依據，同時對各種血管生成相關疾病的診斷、治療提供有益的幫助，具有不可忽視的現實意義。