土家族藥物豆板還陽的HPLC指紋圖譜研究*

張萬濤，李鴻，張鈺，鄭露，涂星

1恩施土家族苗族自治州中心醫院，湖北 恩施 445000；2湖北民族大學醫學部；3風濕病發生與干預湖北省重點實驗室；4湖北民族大學武陵山中藥材檢驗檢測中心

豆板還陽又稱石豇豆、巖澤蘭、石澤蘭、巖豇豆、巖石茶等，為土家族“七十二還陽”藥材之一，為苦苣苔科吊石苣苔屬植物吊石苣苔（Lysionotus pauciflorusMaxim）的地上部分，具有清肺化飲、涼血止血、利濕通絡、調經活血的功效，用于治療咳嗽、支氣管炎、風濕性關節炎、跌打損傷、月經不調、痢疾、鉤端螺旋體、燙傷、疳積等［1-3］。現代研究表明，吊石苣苔中主要含有黃酮類、揮發油類、植物甾醇和三萜皂苷類、苯丙素苷類等多種成分，以“石吊蘭”項被2015年版《中華人民共和國藥典》第一部收載［4-7］。HPLC指紋圖譜屬于中藥色譜指紋圖譜技術，它運用現代分析檢測技術，考察中藥材產地、采收季節、采收部位、炮制加工等信息，在中藥質量控制與真偽優劣評價方面發揮著重要的作用［8］。目前，有文獻對貴州石吊蘭的指紋圖譜特征進行了研究和分析，但關于湖北恩施的豆板還陽的相關文獻報道較少。本研究擬對恩施8批不同產地的豆板還陽進行HPLC指紋圖譜分析并進行相似度比較，為豆板還陽的真偽鑒別和質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 試藥與試劑石吊蘭藥材采集于恩施不同地區，采集方式均為野外采集，經湖北民族大學醫學部朱敏英副教授鑒定為苦苣苔科植物豆板還陽（Lysionotus pauciflorusMaxim.）的干燥地上部分，來源信息見表1。石吊蘭素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111555-200602，純度：98.1%，HPLC級）；阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614，純度：99.0%，HPLC級）；槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-201610，純度：99.1%，HPLC級）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為去離子超純水，其余試劑均為分析純。

表1 豆板還陽樣品來源信息

1.2 實驗儀器LC-2030C液相色譜儀（日本島津，PDA檢測器）；VS-100UE型恒溫超聲提取儀（無錫沃信儀器制造有限公司）；BT-25S型電子分析天平（德國賽多利斯，d=0.01 mg；BSA224S-CW型，d=0.1 mg）；MilliQ超純水系統（貝徠美生物科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備精密稱取P2O5中干燥至恒重的石吊蘭素對照品約10 mg，加甲醇制成100 μg/mL的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備取本品中粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）20 min，放冷，再稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件Inertsustain C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），檢測波長為332 nm，柱溫30℃，乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）為流動相，梯度洗脫：0～25 min，15% A；25～55 min，15%→52%A，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。

2.4 精密度試驗取石吊蘭素對照品（36.76 μg/mL）溶液，按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。以峰面積計算精密度RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗取鶴峰縣走馬鎮樣品，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，照“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以石吊蘭素（tR約為52.3 min，分離度R＞1.5）的色譜峰作為參照峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.37%（n=6），相對峰面積的RSD為0.12%～2.97%（n=6），表明該方法的重復性好。

2.6 穩定性試驗取鶴峰縣走馬鎮樣品，按“2.2”項下制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進樣，按“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以石吊蘭素（tR約為52.4 min，分離度R＞1.5）的色譜峰作為參照峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.50%（n=6），相對峰面積的RSD為0.18%～2.91%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 指紋圖譜分析及相似度評價

2.7.1 參比峰的標定分別取不同產地豆板還陽樣品S1～S8，按“2.2”項下制備供試品溶液，照“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。獲得湖北恩施不同產地的土家族藥物豆板還陽HPLC指紋圖譜疊加圖，見圖1，共有模式圖見圖2。從共有模式圖可知，8個不同地區的樣品中有16個共有峰，經與對照品相比較并結合對照品的保留時間，標定了16號峰為石吊蘭素（tR約為52.4 min），16號的色譜峰分離度好、峰面積較大、穩定性好、為所有樣品共有且石吊蘭素為豆板還陽的主要成分，因此將石吊蘭素峰作為參比峰。

圖1 8批豆板還陽HPLC指紋圖譜疊加圖

圖2 豆板還陽的共有模式圖

2.7.2 相似度評價將樣品S1～S8的HPLC指紋圖譜測定數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012A版）》軟件中，以樣品宣恩縣七姊妹山（S2）的圖譜為參照圖譜，得出豆板還陽樣品的共有模式圖譜，進行相似度評價，結果見表2。

表2 8批豆板還陽樣品相似度分析的結果

2.7.3 共有峰的相對保留時間、相對峰面積采用相對保留時間標定共有峰，即將16號峰作為參比峰，計算8批不同產地豆板還陽樣品共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果見表3—4。

表3 8批豆板還陽樣品共有峰的相對保留時間

表4 8批豆板還陽樣品共有峰的相對峰面積

3 討論

本研究所用的PDA檢測器可實現多波長同步分析，經等高線圖與光譜圖分析后得出，在此色譜條件下，石吊蘭素最大吸收波長為332 nm。

本研究選擇乙腈-0.05%磷酸為流動相進行梯度洗脫，在本研究的色譜條件下各色譜法分離度欠佳、色譜峰拖尾且分析時間較長。因此將原來的0.05%磷酸水提高到0.1%，比較了0～20 min，10%→20%A、20～30 min，20%A、30～80 min，20%→48%A；0～15 min，10%→18%A、15～30 min，18%A、30～80 min，18%→50%A；0～15 min，10%→16%A、15～30 min，16%A、30～80 min，16%→48%A；0～25 min，15%A、25～55 min，15%→52%A等梯度洗脫方法。結果發現在梯度洗脫方法：0～25 min，15%A、25～55 min，15%→52%A下，各色譜峰分離度、峰型較好，分析時長較短，故選擇該方法用于本研究。

在研究中還嘗試用阿魏酸、槲皮素對照品的保留時間定位8個樣品中的這兩個成分，經比較得出樣品中含阿魏酸的地區是：宣恩縣長潭河鄉（S1）、宣恩縣七姊妹山（S2）、咸豐縣高樂山鎮（S4）、宣恩縣高羅鎮（S7）、鶴峰縣走馬鎮（S8）；含有槲皮素的地區是：咸豐縣高樂山鎮（S4）、建始縣花坪鄉（S6）、宣恩縣高羅鎮（S7）、鶴峰縣走馬鎮（S8）。造成這些地區化學成分的差異因素，還有待今后進一步研究論證。

恩施各地區的豆板還陽總體藥材質量差異較大，且與海拔、經緯度關系不大，推測其化學成分的含量可能與生長環境和樣品的采集時間關系較為密切。因此，固定產地，建立豆板還陽的良好農業規范（good agricultural practices，GAP）藥材基地，對提高豆板還陽化學成分的含量、保障其質量的穩定性較為關鍵。

結合圖1—2結果，各色譜峰分離較好，各成分基本相同，建立的方法具有良好的精密度、穩定性、重復性，為以后豆板還陽的真偽鑒別、資源開發利用和質量控制提供參考。