基于PI3K/Akt/mTOR通路探討川芎嗪誘導人胃癌細胞凋亡和自噬作用的機制研究*

霍浩然，秦瑞峰，薛佳棟，袁增江

邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001

近年來，隨著人們健康意識的提高及預防幽門螺桿菌根除等措施的實施，胃癌發病率和致死率呈下降趨勢，但仍居惡性腫瘤致死率的第三位，僅次于肺癌和肝癌［1］。

川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是存在于川芎、溫莪術等植物根莖中的一種活性生物堿，化學名2，3，5，6-四甲基吡嗪，具有較為廣泛的抗腫瘤活性，已證實TMP對肺癌［2］、肝癌［3］、腎癌［4］等具有抑制作用，病理生理學研究發現TMP的抑癌作用可能與促進癌細胞凋亡與自噬有關。磷脂酰肌醇3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是調控細胞凋亡自噬的關鍵信號通路［5］。本實驗旨在研究TMP對胃癌細胞凋亡和自噬的影響以及PI3K/Akt/mTOR通路所發揮的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞人胃癌SGC-7901細胞株，購自中國科學院上海細胞生物學研究所（編號：SCSP-573）。

1.2 藥物及試劑磷酸川芎嗪注射液（揚子江藥業集團有限公司，批號：20191219）；PI3K特異性抑制劑LY294002、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑（tetramethylazoazole，MTT）（美 國Sigma公 司，批 號：L9908、302A035、C208A）；DMEM培養基（美國Hyclone公司，批號：AE20005267）；0.25%胰酶、胎牛血清（南京凱基生物科技發展有限公司，批號：20190416、20190504）；Annexin V-FITC/PI試劑盒（上海碧云天生物技術公司，批號：C1063）；兔抗鼠磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷 酸 化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、β-actin單克隆抗體和山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號190130、190425、190319、190508、181204、190426、190131、190511）；DAB顯色試劑盒（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：20190327）。

1.3 儀器HF240型細胞培養箱（上海力申科學儀器公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國Becton Dicknson公司）；5427R型低溫高速離心機（德國Eppendrof公司）；BX53型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；SE300型蛋白質電泳儀（美國Hoefer公司）；DYCZ-40D型電泳槽（北京六一儀器廠）；Power-pac 3000型轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；VARIOSKANLUX型多功能酶標儀（美國Thermo Scientific公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養實驗用SGC-7901細胞解凍復蘇后接種于含10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養基，置5%二氧化碳、恒溫37℃、飽和濕度的細胞培養箱中進行培養，細胞匯合度約80%時進行傳代；取對數生長期細胞進行實驗，設空白對照組（DMSO）、TMP（200、400、800 μg/mL）［6］和LY2940025 μg/mL［7］干預組。

1.4.2 細胞增殖抑制率檢測取對數生長期SGC-7901細胞經0.25%胰酶消化后，調整細胞濃度為1×104個/mL，200 μL/孔接種于96孔板，繼續培養24 h待細胞貼壁后更換培養基，分別以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL進行干預，每組設10個復孔，48 h后20 μL/孔加入濃度5 mg/mL的MTT溶液，繼續培養4 h后棄培養液，150 μL/孔加入DMSO室溫避光震蕩至結晶完全溶解后，通過酶標儀測定490 nm處吸光度值（OD490nm）。

細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD490nm/空白對照組OD490nm）×100%

1.4.3 細胞凋亡水平檢測取對數生長期SGC-7901細胞經0.25%胰酶消化后，調整細胞濃度為1×104個/mL，200 μL/孔接種于培養皿（內置消毒玻片），培養48 h后更換培養基，分別以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL進行干預，每組設10個培養皿，繼續培養48 h后0.25%胰酶消化、離心半徑10 cm，1500 r/min離心5 min后棄上清，經PBS溶液洗滌3次后，嚴格按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明進行操作，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡水平并計算凋亡率。

1.4.4 細胞自噬水平檢測取對數生長期SGC-7901細胞經0.25%胰酶消化后，調整細胞濃度為1×105個/mL，200 μL/孔接種于24孔板，繼續培養24 h待細胞貼壁后更換培養基，分別以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL進行干預，每組設10個復孔，繼續培養48 h后棄培養液并用PBS溶液洗滌3次，500 μL/孔滴加濃度為1 mg/L的吖啶橙溶液避光孵育15 min，PBS溶液洗滌3次后通過熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4.5 細胞蛋白表達水平檢測取對數生長期SGC-7901細胞經0.25%胰酶消化后，調整細胞濃度為1×104個/mL，200 μL/孔接種于培養皿（內置消毒玻片），培養48 h后更換培養基，分別以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL進行干預，每組設10個培養皿，繼續培養48 h后0.25%胰酶消化、離心半徑10 cm，1500 r/min離心5 min后棄上清取細胞，于冰上裂解細胞后4℃、離心半徑10 cm，12 000 r/min離心15 min去上清，BCA法測定總蛋白濃度后行沸水浴變性，取40 μg總蛋白量上樣、行SDS-PAGE凝膠電泳、濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，滴加p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、LC3、β-actin一抗后4℃孵育過夜，PBS溶液洗滌3伺候滴加二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加DAB顯色劑；以β-actin為內參，通過條帶灰度值半定量蛋白表達量。

1.5 統計學方法運用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TMP對人胃癌SGC-7901細胞增殖抑制率和細胞凋亡的影響與空白對照組比較，TMP（200、400、800 μg/mL）組和LY294002 5 μg/mL組細胞增殖抑制率和凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與LY294002 5 μg/mL組比較，TMP 800 μg/mL組細胞增殖抑制率和凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖1—3。

圖1 TMP對人胃癌SGC-7901細胞增殖抑制率的影響

2.2 TMP對人胃癌SGC-7901細胞自噬的影響紅色熒光為陽性著色，表示自噬溶酶體。與空白對照組比較，TMP 200、400、800 μg/mL組和LY2940025 μg/mL組紅色熒光呈不同程度增多，并且TMP作用呈現一定劑量依賴性，提示SGC-7901細胞經TMP或LY294002干預后自噬溶酶體明顯增多，即TMP具有誘導SGC-7901細胞自噬的作用。見圖4。

圖2 TMP對人胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響

圖3 TMP對人胃癌SGC-7901細胞凋亡率的影響

圖4 熒光顯微鏡下TMP對人胃癌SGC-7901細胞自噬的影響

2.3 TMP對人胃癌SGC-7901細胞p-PI3K、p-Akt、pmTOR蛋白表達的影響與空白對照組比較，TMP 400、800 μg/mL組和LY294002 5 μg/mL組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR相 對 表 達 量 明 顯 降 低（P＜0.05）；與LY294002 5 μg/mL組比較，TMP 800 μg/mL組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR相對表達量降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 TMP對人胃癌SGC-7901細胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達的影響

2.4 TMP對人胃癌SGC-7901細胞Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達的影響與空白對照組比較，TMP 400、800 μg/mL組和LY294002 5 μg/mL組Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9相對表達量明顯提高（P＜0.05）；與LY294002 5 μg/mL組比較，TMP 800 μg/mL組Cleaved Caspase-3相對表達量明顯提高（P＜0.01）。見圖6。

圖6 TMP對人胃癌SGC-7901細胞Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達的影響

2.5 TMP對人胃癌SGC-7901細胞LC3蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-I比值的影響與空白對照組比較，TMP 400、800 μg/mL組和LY294002 5 μg/mL組LC3-Ⅱ、LC3-I相對表達量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值明顯提高（P＜0.01）；與LY294002 5μg/mL組比較，TMP 800 μg/mL組LC3-Ⅱ、LC3-I相對表達量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值明顯提高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 TMP對人胃癌SGC-7901細胞LC3蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-I比值的影響

3 討論

胃癌是全球范圍內最常見的消化系統腫瘤之一，每年新發病例約100萬，每年病死人數約74萬［8］。中醫藥抗腫瘤有獨到的理論體系與診療優勢［9］，胃癌屬中醫“噎膈”“積聚”等范疇，其病機主要在于脾胃虛寒、瘀毒內阻、氣血雙虧所致胃脘氣滯食積、痰凝血瘀、結而成積。

中藥川芎是主產于我國四川省、云南省、貴州省等地的一種傘形科蒿本屬植物，它辛溫香燥，《日華子本草》記載其“上行可達巔頂、下行可達血海”“治一切風、一切氣、一切勞損、一切血，排膿消瘀血”，具有廣泛的活血祛瘀功效。中藥川芎的主要活性成分TMP是一種吡嗪生物堿，既往文獻［10］報道TMP可干預細胞凋亡自噬而抑制腫瘤。本研究發現，TMP可明顯抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖，促進其凋亡和自噬，并且800 μg/mL TMP組對SGC-7901細胞增殖、凋亡和自噬的效應優于LY294002組，提示TMP可促進胃癌細胞凋亡和自噬。

細胞凋亡和自噬是細胞兩條程序化死亡途徑，二者可作為抗癌治療的靶點［11］。因腫瘤局部環境缺氧、Ca2+過載等將導致線粒體膜孔道開放度異常升高，致使線粒體內細胞色素C（cytochrome c，Cyt C）、凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）等釋放進入細胞質，二者能夠陸續活化Caspase-9、Caspase-3蛋白，其中Caspase-3可剪切破壞核酸、膜蛋白、結構蛋白等分子結構而導致細胞凋亡。LC3是細胞自噬的標志性蛋白，分為無生理活性的LC3-Ⅰ亞型和有促細胞自噬活性的LC3-Ⅱ亞型。文獻［12］報道顯示，自噬狀態下無活性的LC3-Ⅰ可酶解一段多肽而成為有自噬活性的LC3-Ⅱ，所以LC3-Ⅱ/LC3-I比值可體現細胞自噬狀況。

Akt為PI3K下游靶基因，其表達與活化受PI3K調控。p-PI3K、p-Akt為二者活化狀態，p-Akt可間接抑制Caspase-3活化而抑制細胞凋亡［13］。mTOR是調控細胞自噬的關鍵蛋白，p-mTOR為其活化狀態，有文獻［14］報道p-mTOR可清除泛素蛋白而阻礙細胞自噬進程，而mTOR磷酸化過程受p-Akt調控。研究發現，給藥干預PI3K/Akt/mTOR通路活化可促進胃癌細胞凋亡和自噬。本研究發現，TMP可明顯降低SGC-7901細胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR相對表達量，提高Cleaved Caspase-3、Caspase-9、LC3-Ⅱ相對表達量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值［15］；除Caspase-9外，800 μg/mL TMP組對其他蛋白表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的效應優于LY294002組，提示TMP促進胃癌細胞凋亡和自噬的作用可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化有關。

綜上所述，TMP可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化而誘導人胃癌細胞凋亡和自噬，本研究結果為TMP做為胃癌治療藥物提供了理論依據。