微生物法測定乳粉中維生素B12的實驗室驗證及結果分析

◎ 蘇妙儀，嚴家俊，綦 艷

（廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東 順德 528300）

維生素B12又名鈷胺素（Cobalamin），是一類含鈷的咕啉類化合物，也是唯一含金屬元素的水溶性維生素，是人體所必需的維生素之一，對人體生理代謝與健康起著至關重要的作用[1-2]。缺乏維生素B12不僅會導致巨幼紅細胞貧血，還會引起心臟病、神經紊亂、老年癡呆和帕金森綜合征等神經系統疾病[3]。人體內不能合成維生素B12，需要從動物性食品中獲取。

嬰幼兒配方乳粉屬于特殊膳食用品，通過在基礎食物中添加多種營養素而得，它主要針對嬰幼兒群體，對嬰幼兒的生長發育起著重要作用[4-5]，也可增加嬰幼兒維生素營養需求的均衡性[6]。為了更好地補充生長發育所需各類營養素，通常6 個月以上的嬰幼兒需要開始添加配方乳粉輔食，因此在嬰幼兒健康發育過程中合理添加配方乳粉至關重要[7-8]。研究表明，中國母乳喂養比例逐年下降，嬰幼兒奶粉已成為更多人的選擇，由此可見，嬰幼兒配方乳粉具有廣闊市場發展前景，其各項指標檢測數據要求也更加精確[9-10]。

維生素B12大多是借助于微生物發酵獲得[11]，其基質復雜，儀器法難以滿足準確測定的要求。目前，傳統微生物法是我國現行有效的檢測標準，同時也是美國官方分析化學家協會和美國藥典推薦的方法。但是，我國現行檢測方法《食品安全標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12的測定》（GB 5413.14—2010）[12]即將被《食品安全國家標準 食品中維生素B12的測定》（GB 5009.285—2022）[13]代替，其第三法微生物法適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品中維生素B12的測定。本研究在GB 5009.285—2022 新國家標準方法的基礎上，優化測試菌液的制備和保存方法[14-15]，從標準曲線線性、準確性、回收率和精密度等結果分析該方法在本實驗室現有條件下的可行性與可靠性，為實驗室開展此項檢測工作提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

萊氏曼士乳酸桿菌（ATCC 7830）：中國工業微生物菌種保藏管理中心；乳酸桿菌瓊脂培養基、乳酸桿菌肉湯培養基、維生素B12測定用培養基：北京陸橋技術股份有限公司；維生素B12標準品：純度≥99%，中國計量科學研究院。

嬰幼兒配方乳粉：貨號QC-IP-703，特性值4.111 μg/100 g，特性值區間3.471～4.752 μg/100 g：中國檢驗檢疫科學研究院；5 組不同品牌的乳粉：隨機購買。

1.2 儀器與設備

5804R 高速冷凍離心機（廣東省中科進出口有限公司）；PHS-3G pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；XGI.D 型真空滅菌器（深圳市宇德立生物科技有限公司）；ZQZY-CS8V 振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司）；酶標儀（德國拜發公司）；UV-1900紫外可見分光光度計[島津（中國）有限公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌懸液的優化制備

參考GB 5009.285—2022 并稍作修改[14]。將萊士曼氏乳酸桿菌的凍干菌株活化后，接種到乳酸菌肉湯培養基上，于(36±1)℃培養24 h。再轉種2～3 代增強活力。將活化后的菌液以8 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，加入10 mL 生理鹽水，混勻。重復洗脫3 次，確保無殘留培養基干擾。加入50 mL 含有25%甘油的維生素B12測定培養基，混勻制成菌株儲備液，分裝到菌株保存管中，每管1 mL，-70 ℃凍存備用。

試驗前從-70 ℃冰箱中取出適量的菌株儲備液，充分混勻。使用9 g·L-1生理鹽水將其稀釋成一定濃度的測試菌液，以9 g·L-1生理鹽水做空白，用紫外可見分光光度計于550 nm 波長下檢測測試菌液的透光率，使測試菌液透光率在60%～80%，待用。經驗證，每10 mL 生理鹽水（9 g·L-1）中加入該批次菌株儲備液600 μL 所得測試菌液透光率在60%～80%，培養生長良好[14-15]。

1.3.2 線性檢驗

（1）工作曲線的配制。按照GB 5009.285—2022中的方法進行標準溶液的配制。①試管法檢測按表1分別加入蒸餾水、維生素B12標準使用工作液和維生素B12測定用培養基于試管中，一式3 份。②微孔法按試管法標準曲線管的制備方式，將體積按比例縮減至1.0 mL 后，在無菌條件下過濾除菌至無菌離心管中，一式3 份。

表1 標準曲線試管法配制表

（2）滅菌。在所有需培養的試管內分別加入一粒玻璃珠，蓋上試管帽，按商品培養基標簽說明進行滅菌（121 ℃滅菌5 min）。而微孔法無需高壓滅菌，但是所需維生素B12測定用培養基需高壓滅菌，然后備用。

（3）接種和培養。①試管法。將滅菌后的試管迅速冷卻至30 ℃以下，除標準曲線管中空白S1 管外，分別向S2～S10 試管中加入預先準備好的1.3.1 測試菌液1 滴（約50 μL），將試管于（36±1）℃培養19～20 h。培養結束后，對每支試管進行目測檢查，未接種試管S1 內培養液應是澄清的，如果S1 管出現渾濁，則測定無效，需重做實驗。②微孔法。維生素B12測定用培養基高壓滅菌冷卻后，每10 mL 培養基中加入菌種測試菌液100 μL，混勻，吸取150 μL 加入微孔板中[16]。另吸取150 μL 1.3.2（1）項下標準系列管加入微孔板中，每個濃度做2 個平行。覆膜，混勻，置于（36±1）℃恒溫培養箱中培養44～48 h[17]。

（4）測定。①試管法。將培養好的標準系列管用漩渦振蕩器混勻，以未接種空白試管S1 作為空白，用1 cm 比色杯于550 nm 處將透光率調節為100%（或吸光度值為0），讀出接種空白試管（S2）的讀數。再以接種空白試管（S2）為空白，調節透光率為100%（或吸光度值為0），依次讀出其他試管的透光率(或吸光度)。②微孔法。再次壓緊粘合箔，將微孔板翻置在桌面上，振蕩使微生物溶解在培養基中。將微孔板翻回如前置于桌面上，從右上角開始以對角線方向180°角輕扯下粘合箔，與此同時務必用另一只手按住放置在桌面上的微孔板，以防止因粘合箔與微孔板粘合過緊而在撕扯時帶起微孔板。破壞微孔中液體表面的所有泡沫(可以用移液管尖或針狀物)。用酶標儀在630 nm[17]條件下讀取吸光度。如果未接種空白試管S1 出現渾濁，說明可能有雜菌污染，需重做實驗。

1.3.3 準確性試驗

采用中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心貨質控樣（貨號QC-IP-703，證書編號003IP02033）作為樣品，按照GB 5009.285—2022 中的方法進行維生素B12的提取，試驗重復6 次。①試管法按表2分別加入蒸餾水、試樣提取液和維生素B12測定用培養基于試管中，一式3 份。同步配制工作曲線，見表1。②微孔法。在無菌條件下將試樣提取液用無菌水相濾膜（0.22 μm）過濾除菌，取4支1.5 mL無菌離心管，分別加入100 μL、200 μL、300 μL 和400 μL 試樣提取液，補無菌水至500 μL。一式3 份。同步配制工作曲線同1.3.2（1）中微孔法。滅菌、接種、培養和測定等具體操作步驟參考1.3.2。將測定的平均含量與其特性值進行相對誤差比較。

表2 待測液的配制表

1.3.4 回收率試驗

稱取約1.0 g 質控樣（貨號QC-IP-703，證書編號003IP02033）12 份于錐形瓶中，精確到0.000 1 g，分為空白、低、中和高4 組，每組3 份。分別準確加入1 ng·mL-1維生素B12標準工作液0 mL、10 mL、50 mL和100 mL 各3 份，按照GB 5009.285—2022 中的方法進行維生素B12的提取、參考1.3.3 準確性試驗進行檢測，根據檢測結果計算回收率。

1.3.5 精密度試驗

隨機選取5 組不同品牌的配方乳粉作為試驗樣品，每組樣品做6 次重復性試驗。用平行結果的相對標準偏差衡量精密度。

2 結果與分析

2.1 線性檢驗

以標準系列管維生素B12含量為橫坐標，每個標準點吸光度值均值為縱坐標，繪制標準曲線得回歸方程，結果見圖1、圖2。試管法和微孔法線性方程的相關系數R2分別為0.993 和0.990，均≥0.99，表明在0～0.1 ng 時，兩種方法的吸光度值與維生素B12含量之間的線性關系良好，滿足檢測要求。

圖1 試管法標準曲線圖

圖2 微孔法標準曲線圖

2.2 準確性試驗

2.2.1 質控樣測定

以中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心的質控樣（貨號QC-IP-703 證書編號003IP02033）作為樣品，檢測結果見表3。試管法與微孔法測定質控樣中維生素B12含量分別為（4.06±0.13）μg/100 g 和（4.13±0.12）μg/100 g，2 種方法所測結果都與其特性值相符，相對誤差為-4.4%～3.4%，2 種方法準確度均符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求。而且試管法與微孔法的RSD 分別為3.2%和3.0%，表明重復性良好。

表3 試管法與微孔法測定質控樣中維生素B12 結果表

2.2.2 加標回收檢驗

在0 ng、10 ng、50 ng 和100 ng 4 個不同的加標量下做3 個平行，計算回收率，結果見表4。試管法平均回收率為99.2%～100.0%，微孔法的平均回收率為100.8%～101.0%，RSD 均＜2%，符合GB/T 27404—2008中關于回收率的要求，方法準確。

表4 試管法與微孔法加標回收檢驗結果表

2.3 精密度試驗

5 種不同品牌的乳粉，每種進行6 次重復性實驗，結果見表5、表6。試管法的RSD 值為2.0%～3.1%，微孔法的RSD 值為1.7%～3.2%，表明兩種方法的重復性均良好。在顯著性水平α=0.05 時，F＜Fcrit，兩種方法無顯著性差異，5 組乳粉兩種方法測定結果一致，符合要求。

表5 試管法重復性檢驗表

表6 微孔法重復性檢驗表

3 結論與討論

微生物法利用相應的營養缺陷型菌種對特定維生素有很強的特異性，在一定條件下，其生長和繁殖速度與溶液中維生素的含量成一定對應關系，可測定具有生物活性的維生素，測定結果準確、范圍廣、靈敏度高，能滿足含量低和基質復雜的特殊食品檢測。維生素B12是萊士曼氏乳酸桿菌生長所必需的營養素。GB 5009.285—2022 中采用微生物法測定維生素B12的原理主要是利用萊士曼氏乳酸桿菌對維生素B12有極高的特異性和靈敏性，在一定條件下，萊士曼氏乳酸桿菌的生長與維生素B12的含量成對應關系，根據維生素B12的含量與透光率（或吸光度值）的標準工作曲線，能定量計算出待測樣品中維生素B12的含量。

GB 5009.285—2022 新國家標準并未對微孔法進行具體操作說明，本研究建立的微孔法是參考即將實施的《食品安全國家標準 食品中葉酸的測定》（GB 5009.211—2022）的標準方法[16]，并結合VitaFast?維生素B12檢測試劑盒[17]中維生素B12培養時間對乳粉中維生素B12含量進行測定。從標準曲線線性、準確性、精密度可知，微孔法與試管法檢測結果無明顯差異，效果相當，能滿足實驗要求。且微孔法具有檢測步驟簡單、省時、操作便捷等優點，在制備樣液過程中無需高壓滅菌，操作簡單，在培養過程中能大大降低培養箱空間，培養結束后直接運用酶標儀即可測量相關數據，極大地節省了檢測時間。而試管法需用到大量試管、器皿等，清洗要求較高且煩瑣，在滅菌和培養時占用空間大，使用分光光度計測量吸光度值時需要較長時間。在工作中，可根據實際情況選擇合適的方法。

本研究在GB 5009.285—2022 新國家標準方法的基礎上，優化了測試菌液的制備和保存方法，通過分析標準曲線線性，對QC-IP-703 質控樣和5 組不同品牌的乳粉進行檢測以及加標回收試驗。驗證結果表明，試管法和微孔法標準曲線線性關系R2≥0.99，準確性以及精密度等滿足標準方法要求，可操作性強。因此，本實驗室具有開展GB 5009.285—2022 微生物法測定乳粉中維生素B12的檢測能力，可以開展此項檢測工作。