全自動固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定大米中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素

◎ 張樹權，周瑞錚，易華娟，林秋鳳，鄭耀林

（東莞市食品藥品檢驗所，廣東 東莞 523808）

香精所具有的濃郁香氣可以起增香、定香的作用，其中香蘭素及其衍生物的應用十分廣泛，是使用最多的食品增香劑之一。乙基香蘭素等香精通過人工合成的方式得到，而香蘭素則存在于眾多自然植物中，被提取出來后通過人工合成的方式進行大量生產，并廣泛用于食品加工中。然而有關研究表明，過量食用香蘭素等有出現頭暈、惡心、嘔吐、呼吸困難以及損傷肝腎等風險[1]，而香豆素更被列入第三類致癌物清單中[2]?！妒称钒踩珖覙藴?食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）[3]中明確規定大米中不得使用天然香精或合成香精，但為了提高大米的銷售利潤，常有不法商家在大米中添加香蘭素等增香劑冒充優質大米。大米除了作為主食，還是重要的食品加工原料，大米的質量控制對人們的生命健康安全的重要性不言而喻。然而目前尚未頒布檢測大米中香蘭素等香精的食品安全國家標準，市場監督管理總局發布的食品補充檢驗方法《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定》（BJS 201705）[4]操作過于簡單，不能有效除去大米中的雜質，尤其是可溶性脂類容易污染離子源，不利于儀器的維護使用。目前，針對香蘭素等香精的研究主要考察的是奶粉[5-10]、飲料[11-15]、乳制品[16-17]和植物油[18-19]等基質，本文采用全自動固相萃取儀結合超高效液相色譜-串聯質譜法對大米中香蘭素等常見4 種香料進行檢測，能夠提高大批量檢驗的工作效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試樣來源：所用15 批試樣均為東莞市各大米廠家送檢的大米。

標準品：香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素，純度均不小于99%，批號分別為D0016913、D0019465、D0016050、F0031598，北京BePure 公司。

甲醇：色譜純，德國默克公司；甲酸：分析純，德國默克公司；固相萃取小柱：Oais HLB，60 mg/3 mL，美國沃特世公司；微孔濾膜：PTFE，孔徑0.22 μm，天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 儀器與設備

TRIPLE QUAD 5500+超高效液相色譜串聯質譜儀，美國AB SCIEX 公司；FotectorPlus 全自動固相萃取儀，中國?？萍瘓F股份有限公司；CPA225D、BSA223S電子分析天平，德國賽多利斯公司；3K 15 離心機（9 500 r·min-1），德國Sigma 公司；Milli-QReference超純水機，德國默克公司；BC-1000 渦旋振蕩儀，深圳逗點生物技術有限公司；CPX880H-C 超聲波清洗機，美國Branson 公司；Evatros 自動氮吹儀，韓國Goojung 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的制備

分別準確稱取香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素標準品各10 mg，分別置于10 mL 容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為1 mg·mL-1的單標準儲備液。

分別準確吸取適量上述單標準儲備液，用70%甲醇水溶液稀釋至濃度均為10 μg·mL-1的混合標準溶液。

用70%甲醇水溶液將混合標準溶液稀釋成質量濃度為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1標準系列工作溶液，臨用時配制。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Atlantis T3（2.1 mm×100 mm，3 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為甲醇；進樣體積：1.0 μL；流速：0.3 mL·min-1；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫梯度：0～0.5 min，25%B；0.5～2.0 min，25%～50%B；2～4 min，50%B；4.0～4.1 min，50%～90%B；4.1～6.5 min，90%B；6.5～6.6 min，90%～25%B；6.6～10 min，25%B。

（2）質譜條件。離子源：電噴霧離子源（H-ESI+，正離子模式）；掃描模式：多反應監測；霧化氣：50 psi（氮氣）；輔助氣：50 psi（氮氣）；氣簾氣：30 psi（氮氣）；噴霧電壓：5 500 V；去溶劑溫度：500 ℃；碰撞氣：8 psi（氮氣）。離子對優化結果見表1。

表1 離子對優化結果表

1.3.3 實驗步驟

準確稱取1.00 g（精確至0.01 g）試樣，加入10 mL甲醇，渦旋振蕩5 min，超聲提取10 min 后，8 000 r·min-1離心5 min，轉移全部上清液至玻璃試管，加入一級水將上清液稀釋至40 mL，待凈化。用全自動固相萃取儀將全部稀釋液經過活化的HLB 固相萃取柱，再用3 mL 35%甲醇水溶液淋洗，抽干小柱，用3 mL 甲醇洗脫，用刻度試管收集洗脫液并于40 ℃氮吹濃縮至接近0.1 mL，準確加入70%甲醇水溶液至1 mL 刻度，渦旋振蕩30 s，過0.22 μm PTFE 微孔濾膜后，待測。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的選擇

常見的流動相體系有甲醇-水和乙腈-水體系，在此基礎上正離子模式中常加入甲酸、乙酸銨等對峰形和保留時間進行改善。本實驗對以上幾種流動相體系進行比較，發現在同一梯度洗脫條件下，甲醇-水體系對甲基香蘭素和乙基香蘭素的分離效果優于乙腈-水體系；而加入甲酸或乙酸銨等緩沖鹽的流動相對保留時間無明顯影響，添加甲酸后各個組分的響應均有明顯增強，但加入乙酸銨對各個組分的響應有明顯的抑制作用。此外，本文比對了添加0.05%～0.20%甲酸對色譜峰的影響，結果發現增加酸濃度對分析物保留時間無明顯影響，與相關文獻[19-21]報道情況相符，綜合色譜柱保養以及分離效果的考慮下，選用0.1%甲酸。因此，本文最終選用甲醇-0.1%甲酸水作為流動相，該條件下色譜峰圖譜見圖1。

圖1 色譜圖

2.1.2 色譜柱的選擇

由于香蘭素等4 個組分均有一定的極性，且甲基香蘭素和乙基香蘭素互為同分異構體，對分離要求較高，因此本文選擇對極性分子分離效果較好的3 根反相色譜柱進行比較。經過比較，在甲醇-0.1%甲酸水溶液體系下Atlantis T3 的峰形與分離效果較好，因此選用Atlantis T3 柱為色譜柱。

2.2 前處理方法優化

2.2.1 提取溶劑的選擇

香蘭素、甲基香蘭素等4 個組分在醇類、酯類等極性有機溶劑中有較好的溶解性，且組分多呈弱酸性，因此本實驗選取比較了1%氨水、甲醇、乙腈和乙酸乙酯等4 種提取溶劑，考察其對大米中香精的提取效率。在樣品中加入濃度為10 μg·mL-1的混合標準溶液0.1 mL，即添加濃度為1 mg·kg-1，將樣品混合均勻并靜置30 min，用10 mL 上述4 種溶劑分別進行提取。由圖2可知，1%氨水對香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的提取效率在85%以上，但對香豆素的提取效率不佳，只有30%左右；而乙酸乙酯對4 種組分的提取效率均在85%以上，甲醇和乙腈的提取效率均能達到90%以上，且甲醇略優于乙腈，因此3 種溶劑的提取效率為甲醇>乙腈>乙酸乙酯。在提取過程中，甲醇和乙腈的提取液較為澄清，樣品離散效果好，而1%氨水和乙酸乙酯的提取液較為混濁。這是由于大米中的水溶性雜質和淀粉容易溶解在1%氨水中，油脂類雜質更易溶于乙酸乙酯中。此外，與乙腈相比，甲醇的毒性相對較小，價格低廉，適合大批量檢驗提取，且選取甲醇作為提取溶劑時，儀器基線平穩，無明顯雜峰干擾。因此，本文選用甲醇作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑提取效率對比圖

2.2.2 提取方式及時間的優化

本實驗以甲醇為試劑進行提取，分別比較了渦旋振蕩、超聲提取以及兩種方式混合提取的提取效果。在樣品中添加適量標準儲備液，制備成含量為1 mg·kg-1的加標樣品，將加標樣品充分混勻并靜置30 min 后進行提取，分別于渦旋振蕩、超聲提取和復合提取的條件下測定其提取效率。結果表明，渦旋振蕩和超聲提取的時間分別在達到10 min 和20 min 后提取效率基本不再增加；渦旋振蕩的整體提取效率只能達到90%左右，與超聲提取（95%）相比略低，但超聲提取所需時間較長；采用復合方式進行提取，在渦旋振蕩5 min 并超聲提取10 min 的提取條件下，不僅能獲得同樣的提取效果，還能縮減提取時間，因此最佳提取方式為渦旋振蕩5 min 及超聲提取10 min 的復合方式。

2.2.3 全自動固相萃取儀凈化及氮吹濃縮處理

采用固相萃取柱處理樣品，不僅能對樣品溶液進行凈化，降低樣品的基質效應，還能濃縮樣品溶液，富集檢測目標物進而降低檢驗方法的檢出限，但是固相萃取柱凈化過程往往較為煩瑣、且耗時較長。近年來，有研究表明[22-23]，全自動化的前處理輔助設備的需求和用途越來越大，全自動固相萃取儀可有效節省檢驗人員的時間，能自動同時處理多個樣品，提高工作效率，而且儀器采用的全封閉式操作能大大降低污染和失誤操作的風險，減小人為誤差，能獲得更好的回收率和精密度。本實驗選取了HLB、MAX 和C183 款固相萃取小柱，并對凈化效果進行比較。經過比對發現，C18對于各個組分的保留能力較弱，未能較好地吸附檢測組分，這是由于香蘭素、乙基香蘭素等組分呈弱酸性且具一定的極性，因此具備陰離子吸附作用的MAX 固相小柱和親水親脂平衡型的HLB 的保留效果均較好，且HLB 固相小柱在35%甲醇-水溶液的淋洗條件仍對4 個檢測組分具有極好保留能力，而MAX 在25%甲醇-水溶液條件下進行淋洗時檢測組分隨著甲醇比例的增加逐步開始流失，HLB 固相小柱的保留能力和凈化除雜能力優于MAX 固相小柱，因此本實驗選用HLB 固相小柱作為凈化柱。在氮吹濃縮的過程中，發現濃縮液一旦完全吹干，將會使各個組分的回收率降低，而氮吹濃縮至0.1 mL時補液至1 mL，可有效避免檢測組分的損失。

2.2.4 防止污染帶入

香蘭素用途廣泛，除了在食品中應用外，還被用于橡膠、塑料等工業用品中，因此實驗過程中的器具耗材可能會帶入香蘭素的污染，對實驗結果產生影響。本實驗對操作中使用過的器具耗材（塑料離心管、移液器槍頭、一次性注射器、微孔濾膜、固相萃取柱、進樣瓶蓋及墊片等）使用玻璃器皿盛裝，用適量甲醇浸泡并超聲20 min，濃縮至1 mL 進行檢測。發現聚丙烯、聚四氟乙烯等高分子材料的器皿耗材不會帶入香蘭素，而常用的尼龍微孔濾膜有香蘭素溶出，浸出液濃度約為10 ng·mL-1，對實驗結果造成一定的影響，容易造成假陽性的現象。因此本實驗所用器皿耗材均為聚丙烯、聚四氟乙烯或玻璃材質。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系

本實驗采用外標法，以系列標準溶液的質量濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。如表2所示，各組分在1～500 ng·mL-1線性關系良好，相關系數R均大于0.999。以定量離子的3 倍信噪比（S/N=3）為檢出限，測定各組分的檢出限，發現各組分的檢出限為1.5～4.7 μg·kg-1。

表2 線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限表

2.3.2 加標回收率及精密度

選取低（10 μg·kg-1）、中（50 μg·kg-1）、高（100 μg·kg-1）3 個添加水平，每個添加水平平行稱取6 份樣品，按1.3.3 的步驟對樣品進行處理，測定方法的回收率及其精密度。如表3所示，各組分回收率在80.1%～89.3%，RSD 為1.7%～3.9%，滿足日常檢驗的要求。

表3 加標回收率和相對標準偏差表（n=6）

2.4 樣品實測結果

本實驗對東莞市多家糧食生產企業以及其他省份糧食生產企業生產的15 批市售大米中香蘭素等4 種香精的含量進行了測定。結果顯示，所檢樣品中均檢出香蘭素，樣品中香蘭素含量為52.3～242.8 μg·kg-1，甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素均未檢出。采用市場監督管理總局發布的食品補充檢驗方法《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定》（BJS 201705）重新測定香蘭素含量，測得樣品中香蘭素含量為55.1～258.3 μg·kg-1，同一樣品測定結果的相對平均標準偏差為4.1%～9.4%，說明本實驗方法具有實際可行性。

3 結論

本研究建立了全自動固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定大米中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素4 種香精的分析方法，以甲醇為溶劑進行提取，經渦旋和超聲提取，用水稀釋后通過全自動固相萃取儀，使用Oasis HLB 固相小柱凈化，氮吹至近干后復溶上機。結果發現4 種香精在質量濃度為1～500 ng·mL-1時線性關系良好，平均加標回收率在80.1%～89.3%，RSD 為1.7%～3.9%。該方法增加固相萃取步驟進一步凈化樣品，同時利用全自動固相萃取儀實現樣品凈化全自動化操作，相比現有的大米檢測方法極大節省了時間和人力，簡便有效，能為相關食品安全的檢驗工作提供一定的技術參考。