黑骨藤藥材質量標準提升研究

祝清燦，鄒良梅，孫宜春，李慧馨，段 麗，石 亞

(國藥集團同濟堂[貴州]制藥有限公司，貴州 貴陽 550026)

黑骨藤藥材來源于蘿摩科植物黑龍骨PeriplocaforrestiiSchltr.的干燥根或全株，一般于秋、冬二季采挖，洗凈，切段，曬干。黑骨藤收錄于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》(2003年版)，為貴州少數(shù)民族用藥，一般生長于海拔2 000 m以下的山地疏林向陽處、河谷地帶、蔭濕的雜木林下或灌木叢中，主要分布于云南、貴州、四川、廣西、西藏和青海等省區(qū)，該藥氣微香，味苦，具有通經(jīng)、活血、解毒及祛風等功效，用于風濕關節(jié)痛、跌打損傷和月經(jīng)不調等[1-3]。黑骨藤主要有效成分包括強心苷類、甾類、三萜類、黃酮類、蒽醌類、苯丙素類化合物[4]。其中苷類及強心苷類，主要化學成分為杠柳毒苷(periplocin)、蘿藦苷元(periplogenin)、8-羥基蘿藦苷元(8-hydroxyperiplo-genin)、滇杠柳苷(periforside)、胡蘿卜苷(daucosterol)等[5-7]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，黑骨藤具有抗炎、抗風濕、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等藥理作用[8-10]。近年來，國內外對于黑骨藤藥理作用和臨床應用的研究較多，但對其質量標準的研究較少，原先的標準項僅收載性狀和理化鑒別項，不利于其質量控制。因此，貴州省藥品監(jiān)督管理局將黑骨藤納入《貴州省中藥材、民族藥材質量標準研究》計劃，本研究通過對黑骨藤進行顯微鑒別和薄層色譜鑒別研究，按《中華人民共和國藥典》規(guī)定的方法對水分、總灰分、浸出物進行測定，以期為質量標準的修訂提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

WHF-3型三用紫外分析儀(武漢藥科新技術開發(fā)有限公司生產(chǎn))；CX41型顯微鏡(OLYMPUS CORPORATION)；101-2A型電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋[常州普天儀器制造有限公司(金壇市晶玻實驗儀器廠)]，ME204TE/02型電子天平[梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司]；SB25-12DTS型數(shù)控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

杠柳毒苷對照品(批號：111793-200901)，購自中國食品藥品檢定研究院；三氯甲烷(批號：20170801)、乙酸乙酯(批號：2016071501)、硫酸(批號：20170301)、環(huán)己烷(批號：2016051901)、甲醇(批號：20161001)、乙醇95%(批號：20170901)均購自重慶川東化工(集團)有限公司；三氯甲烷、乙酸乙酯、硫酸、乙醇、甲醇、環(huán)已烷等均為分析純；水為自制純化水。

1.3 材料

硅膠G薄層板(批號：20170929)、硅膠G高效板(批號：20170831)均購自青島海洋化工有限公司；自制硅膠G薄層板(薄層層析硅膠用G，批號：0151008，200目，青島海洋化工有限公司)。本研究所用樣品均由國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司種植部提供，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院何順志教授鑒定為蘿摩科植物黑龍骨PeriplocaforrestiiSchltr.的干燥根或全株。憑證標本存放于國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司。樣品來源信息，詳見表1。

表1 樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

將樣品(全株)粉碎(過四號篩)，經(jīng)肉眼觀察并制片置顯微鏡下觀察。其特征為：本品粉末灰褐色；木栓細胞多角形、類方形，內含黃棕色至紅棕色物；纖維多見，薄壁細胞含草酸鈣方晶與纖維形成晶鞘纖維；草酸鈣方晶較多，散在或存在于薄壁細胞中；石細胞類長方形、類圓形或橢圓形，單個或成群散在；導管多為具緣紋孔，排列緊密，少見螺紋導管。 黑骨藤粉末顯微特征，見圖1。

注：1.木栓細胞；2.晶鞘纖維；3.草酸鈣方晶；4.石細胞；5.導管。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 供試品溶液制備 取本品粉末4 g，加水50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液[11]。

2.2.2 對照品溶液制備 取杠柳毒苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液[12]。

2.2.3 薄層鑒別方法與結果 按照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗[13]，分別吸取上述對照品溶液2～5 μL，供試品溶液3～7 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲苯(15∶5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105～110 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。黑骨藤薄層色譜，見圖2。

注：1、2、4為供試品；3、5為杠柳毒苷對照品。

2.3 水分含量測定

精密稱取10批黑骨藤藥材粉末(過二號篩)約4 g，按照2020年版《中國藥典》(四部)通則“0832水分測定法”的第二法(烘干法)進行測定[13]，每批樣品平行測定兩份，取平均值。結果，10批樣品中水分的含量最低為8.8%，最高為12.3%，平均值為10.35%，以平均測定值的120%設限，為12.42%，故建議將水分標準定為不得過13.0%。黑骨藤藥材水分含量測定結果，見表2。

2.4 總灰分含量測定

精密稱取10批黑骨藤藥材粉末(過二號篩)各約2.5 g，按照2020年版《中國藥典》(四部)通則“2302灰分測定法”的第一法(總灰分測定法)進行測定[13]，每批樣品平行測定兩份，取平均值。結果，10批樣品中總灰分的含量最低為8.7%，最高為12.3%，平均值為10.25%，以平均測定值的120%設限，為12.3%，故建議將總灰分標準定為不得過12.5%。黑骨藤藥材總灰分含量測定結果，見表2。

2.5 浸出物含量測定

取10批黑骨藤藥材粉末(過二號篩)各約3 g，照水溶性浸出物測定法(《中國藥典》2020年版四部通則2201)項下熱浸法測定[13]，用水作溶劑，每批樣品平行測定兩份，取平均值。結果，10批樣品中浸出物最低值為4.8%，最高值為7.2%，平均值為5.84%，以平均值的80%設限，為4.67%，故建議將浸出標準定為不得少于5.0%。黑骨藤藥材浸出物含量測定結果，見表2。

表2 黑骨藤水分測定結果

3 討論

3.1 開展本研究的必要性

黑骨藤藥材質量標準收錄于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準研究》(2003年版)，該標準中僅有性狀、黑骨藤根的顯微鑒別和理化鑒別，其顯微鑒別為根的顯微特征，由于黑骨藤藥材來源于蘿摩科植物黑龍骨PeriplocaforrestiiSchltr.的干燥根或全株，故需對黑骨藤藥材全株進行顯微鑒別方法研究。同時，王強等[14]認為，原標準理化鑒別中使用3，5-二硝基苯甲酸試液、3，5-二硝基苯甲酸試液在配制和使用時有錯誤，其理化鑒別方法專屬性不強，不能很好控制黑骨藤藥材質量。因此，貴州省藥品監(jiān)督管理局將黑骨藤納入《貴州省中藥材、民族藥材質量標準研究》計劃，本研究開展了對黑骨藤質量標準的系統(tǒng)提升研究，以期為黑骨藤質量標準修訂提供參考。

3.2 供試品溶液制備

根據(jù)化學成分的溶解性，分別對提取溶劑(水、甲醇、乙醇)，提取方法(超聲、回流)，提取溶劑用量(15 mL、25 mL、35 mL)，提取時間(30 min、60 min、90 min)，樣品取樣量(1.0 g、2.0 g、3.0 g、4.0 g)等條件進行考察，結果表明，以本研究中制備方法制備的供試品溶液鑒別斑點最清晰。

3.3 薄層色譜條件考察

根據(jù)展開樣品主要化學成分的極性，對展開系統(tǒng)如石油醚-三氯甲烷(1∶1.5)、正己烷-乙酸乙酯-甲酸(7.5∶5∶0.8)、三氯甲烷-甲醇-甲苯(15∶5∶0.5)、三氯甲烷-甲醇(10∶3、25∶1)，硅膠板(不同廠家)，點樣量(2 μL、3 μL、5 μL、7 μL、10 μL)，薄層板預平衡時間(0 min、10 min、20 min)，展開溫度(5 ℃、25 ℃、30 ℃)等進行了考察。結果表明，使用本研究中所用的色譜條件，展開效果較好，斑點清晰，偽品無相應斑點。

3.4 浸出物測定方法考察

在進行浸出物測定時，對浸出方法(冷浸法、熱浸法)，浸出溶劑種類(水、乙醇、甲醇)，浸出溶劑濃度(30%，50%，70%)進行了考察，結果，使用本研究的浸出方法和溶劑測定時，浸出物含量最高。

綜上，黑骨藤的顯微鑒別特征清晰易見；薄層色譜鑒別方法專屬性強，薄層色譜斑點清晰，分離度較好，偽品無相應斑點；增加水分、總灰分、浸出物檢查后，質量標準更完善；本研究可以為提高黑骨藤藥材的質量控制標準提供科學依據(jù)。