一種龍須菜中純化藻紅蛋白的新方法

崔佳敏，李 敏，左 旸，蒲 洋

（魯東大學 農學院，山東煙臺 264000）

藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）作為一種重要的藻膽蛋白，是紅藻、藍藻光合作用的捕光色素蛋白之一[1-2]。水溶性的PE作為天然色素在食品領域、化妝品領域和染料領域等具有廣泛的應用[3]。同時PE獨特的光學特性能夠用于熒光標記探針、光敏材料等的制作[4-5]。不同純度（Aλmax/A280）的PE用途不同，食品級純度大于0.7，藥品級純度大于3.0，PE的純度在極大程度上決定了其價值[6]。

龍須菜（Gracilariopsis lemaneiformis）作為實現了南北方海域大規模人工栽培的江蘺科（Gracilariaceae）海洋紅藻，富含紅藻多糖和多種有益營養物質，不僅具有水域生態修復功能，還是提取瓊膠的優良原材料和具有高保健價值的天然食品[7-8]。作為我國人工栽培規模名列前茅的大型經濟海藻，目前主要用于瓊膠制取和食用，其潛在的經濟價值有待進一步開發[9-10]。其中富含的PE為三峰型的Ⅰ型R-PE，可見光區吸收光譜中，于498 nm、540 nm和565 nm有3個明顯吸收峰，且最大峰值位于565 nm處[11]；多波長的激發光激發，都會獲得580 nm為最大峰的特征熒光發射光譜。截至目前，這種高價值的PE還未被很好地開發和利用。

PE的純化方法決定了其純度以及經濟價值，也對其進一步的開發和利用有決定性作用。目前國內外報道了很多分離純化龍須菜中所含蛋白質的工藝，主要包括細胞破碎、硫酸銨分餾及柱層析等步驟[12-13]。破碎細胞的方法主要包括超聲破碎、組織搗碎、反復凍融法和溶脹法等；得到組織破碎液后，再通過硫酸銨分級沉淀、等電點沉淀和超濾等方法進行粗提；最后綜合利用羥基磷灰石、分子篩（Sephadex G-100）、離子交換（DEAE-Sepharose Fast Flow）等層析介質進一步純化PE[14-16]。但通過疏水層析介質純化龍須菜PE的方案還未見報道。

本研究在低溫下，采用組織勻漿機破碎采集的龍須菜藻體，硫酸銨沉淀后用磷酸鹽緩沖液重懸得到PE二次粗提液，再依次運用疏水層析介質和分子篩層析介質進行PE純化，獲得藥品級純度的最終產品。此創新性純化工藝的應用，為龍須菜PE的高值化產品的開發和應用奠定了技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍須菜來自廣東汕頭南澳島，清水清洗多遍去除表面污泥與石沙，-20 ℃冷凍備用。Na2HPO4（國藥集團產品）；NaH2PO4（國藥集團產品）；(NH4)2SO4（國藥集團產品）。

1.2 粗提

本研究采用組織破碎法對龍須菜進行細胞破碎。把清洗干凈的龍須菜瀝干水分后剪碎，并置于-20 ℃。將冷凍的龍須菜放入組織勻漿機，少量多次加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液，在4 ℃條件下進行勻漿破碎，3層紗布過濾后，經12 000 r·min-1離心20 min，所獲上清即為PE粗提液。

1.3 (NH4)2SO4初步純化

粗提液中加入（NH4)2SO4使溶液飽和度達到20 %，4 ℃靜置2 h，之后4 ℃環境下12 000 r·min-1離心15 min，取上清液繼續添加(NH4)2SO4使溶液飽和度達到45%，4 ℃靜置2 h，之后4 ℃環境下12 000 r·min-1離心20 min。取沉淀后用磷酸鹽緩沖液重懸，將含有PE的硫酸銨二次粗提液經0.22 μm濾膜過濾后備用。

1.4 疏水層析

使用疏水層析介質（Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow，GE，USA），通過含有2.5 mol·L-1(NH4)2SO4，pH值為6.8的20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液平衡3個柱體積。0.22 μm濾膜過濾后的二次粗提液用于上樣，并使用柱平衡緩沖液作為流動相，使目的蛋白與疏水柱介質結合，流速為2 mL·min-1，共3個柱體積。隨后使用3個柱體積量，含有1.0 mol·L-1(NH4)2SO4的20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液洗雜，同時用核酸蛋白檢測儀測定洗脫曲線，直至吸光值不再變化，最后20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液洗脫并收集純化后的目標PE。

1.5 分子篩層析

使用分子篩層析介質（Sephadex G-100），以pH值為6.8的20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液平衡3個柱體積，緩慢加入上述疏水層析得到的樣品，以500 μL·min-1的流量進行洗脫，約40 min后開始收集PE洗脫液。龍須菜PE分離純化流程圖見圖1。

圖1 龍須菜PE分離純化流程圖

1.6 純度測定

龍須菜中PE的最大特征吸收峰為565 nm，PE純度表示為Amaxpeak/A280[17-20]。

1.7 SDS-PAGE電泳檢測

將粗提液和最終純化得到的高純度PE進行SDS-PAGE電泳檢測。先通過20 mmol·L-1ZnSO4溶液染色20 min后，于紫外光下，拍攝熒光圖像，再用考馬斯亮藍G250染液染色20 min，脫色后拍照，檢測PE條帶的特性[21-22]。

1.8 紫外可見光光譜測定

使用紫外可見光分光光度計（Denovix，USA）對PE樣品進行光譜掃描，光徑1 cm，掃描范圍為

250～700 nm[23-24]。

1.9 熒光發射光譜測定

使用熒光分光光度計（Agilent，USA）對PE樣品進行熒光發射光譜測定，應用436 nm和545 nm波長激發，檢測熒光發射光譜[25-26]。

2 結果與分析

2.1 PE的層析純化

對龍須菜進行破碎處理，離心后得到純度為0.05的蛋白粗提液（表1）。首先用飽和度為20%的(NH4)2SO4進行后續處理，上清液中的PE純度達到0.06。在之前的研究中，付曉蘋等[27]用紅毛藻分離純化PE，(NH4)2SO4沉淀溶液的純度比PE粗提液的純度增幅為229%。王盛等[17]用珊瑚藻分離純化PE，(NH4)2SO4沉淀溶液的純度比PE粗提液的純度增幅為161%。為進一步提高PE的純度，將經20%(NH4)2SO4處理所得上清液的硫酸銨飽和度提升到45%獲取沉淀，用磷酸鹽緩沖液重懸后測得純度為0.77。經疏水柱層析處理，洗脫后的PE，純度大幅度增加到了3.01。再經分子篩層析洗脫后，最終獲得的高純度PE純度達到3.80。

表1 各步驟所得PE純度

20 % (NH4)2SO4沉淀所得PE上清液，在疏水層析的梯度洗脫中得到的洗脫圖譜（A280），純化過程中共有2個明顯的洗脫峰（圖2）：第1個洗脫峰較小，主要是流動相為結合緩沖時，PE與輸水介質結合過程中，未結合的無色雜蛋白，結合過程同時具有洗雜的效果；第2個洗脫峰是用20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液洗脫，所得的紅色部分，即目的PE。

圖2 PE的疏水柱層析洗脫圖譜圖

2.2 PE可見光光譜特征

圖3為粗提液和最終洗脫液中PE的吸收光譜圖。由結果可知，經疏水柱-分子篩柱層析洗脫得到的PE，可見光區吸收在565 nm和498 nm處有完全吸收峰，在535 nm處有肩峰，其中565 nm處為最大吸收峰[28]。最終得到的高純度PE的可見光吸收光譜特征與文獻報道的一致[19-20,25,29]。對比粗提液中的PE在565 nm和498 nm處特征吸收峰強度較低，峰型不明顯。則進一步證明，經疏水柱-分子篩柱層析，PE純度得到了極大的提高。

圖3 PE可見光光譜圖

2.3 SDS-PAGE電泳鑒定

通過SDS-PAGE對得到的PE進行進一步分析驗證，實驗結果如圖4所示，其中圖4（a）為紫外光下Zn2+加強的熒光自顯影結果，圖4（b）為考馬斯亮藍G250染色后的條帶。通過兩者相互印證，最終純度為3.80的PE（泳道A和C）在預計的位置共有3條帶，相對分子質量從小到大分別約為12 kDa、17 kDa和35 kDa。這與報道的R-PE的α和β亞基大小在15～25 kDa，35 kDa處條帶為PE的γ亞基的結果一致[23,30]。而PE粗提液電泳結果中（泳道B和D），除了相同位置的3條能夠發射熒光的條帶外，仍然含有大量的其他雜蛋白條帶，這進一步證明了最終得到的PE達到了所需的高純度。

圖4 PE的SDS-PAGE電泳圖

2.4 熒光發射光譜特征

熒光發射光譜能夠用于驗證其光能傳遞特性。粗提液和最終純化得到的PE，分別用436 nm和545 nm波長的光激發，最大熒光發射峰都位于578 nm處（圖5）。與之前報道結果相似，表明純化后的PE基本保持了完整的分子結構和光能傳遞性能[14]。熒光發射光譜除了反映藻膽蛋白內部能量轉移的能力，也可用來識別強特異性的色基分子量子態。檢測到的熒光特性同時表明，新純化方法得到的R-PE能夠正確完成能量傳遞功能[31-32]。同時由于結構對功能的決定作用，這一結果能夠反向證明R-PE中色基所處的蛋白微環境和量子態結構沒有發生改變，進一步證明了這一新純化方法的可靠性。

圖5 PE熒光發射光譜圖

2.5 Gauss解疊

為了更進一步驗證純化得到的R-PE保持了天然的光學活性，對純化后PE的吸收光譜進行Gauss解疊運算[25]。如圖6（a）所示，總共得到3個峰，分別對應吸收光譜的3處吸收峰（498 nm、535 nm、565 nm）。Gauss解疊的R2為0.994 12，結果可信度高，與組成R-PE不同種類色基的吸收光譜相吻合。545 nm波長激發得到的熒光發射圖譜的解疊結果如圖6（b）所示，解疊后得到分別位于578 nm和618 nm處的兩個峰，Gauss解疊得到的R2為0.997 15。可見光吸收光譜和熒光發射光譜解疊后的理論計算驗證也確證了其天然的光學活性沒有發生改變。

圖6 PE可見光和熒光發射光譜解疊圖

3 結論

目前從不同藻類植物中分離純化PE的方法有很多報道，不同的純化方法有其各自的優缺點。本論文從龍須菜中獲得粗提液，用分級(NH4)2SO4初步純化，再通過疏水柱-分子篩柱層析，獲得藥品級純度的R-PE。此外，通過紫外可見光吸收光譜、SDS-PAGE、熒光發射光譜以及Gauss解疊運算分析方法，驗證了該純化工藝的可行性。通過與已有報道對比驗證，證明純化后的R-PE保持了天然的光學活性，且蛋白結構也未發生改變。與之前報道的分離方法相比，此方法的優點在于分離純化工藝簡潔，且同樣具有良好的分離效果。