超聲波有機(jī)溶劑法浸出柚皮苷最佳條件研究

曹威威，李岳姝

（黑龍江工業(yè)學(xué)院，黑龍江雞西 158100）

柚子為蕓香科柑橘屬植物，原產(chǎn)于東南亞，在中國已有3 000多年的栽培歷史。浙江、江西、廣東、廣西、福建、湖南、湖北、四川、貴州和云南等省均有栽種。隨著近年來柚子產(chǎn)量的穩(wěn)步增加，我國已成為世界上最大的柚子出口國和消費(fèi)國。在產(chǎn)量方面僅次于美國，位居世界第二位。柚子經(jīng)食用或加工后，大量的柚子皮被直接丟棄，約占整個(gè)柚子質(zhì)量的30%以上。丟棄的柚子皮因大量堆積而腐爛不僅會影響周圍居民的生活，還會造成資源的浪費(fèi)[1]。研究發(fā)現(xiàn)在柚皮中有很多具有生物活性的有機(jī)物質(zhì)，主要為果膠、酮類及揮發(fā)性油類（精油），其中柚子皮中柚皮苷約占黃酮類物質(zhì)的80%以上[2-3]。柚皮苷是一種二氫黃酮類物質(zhì)，屬于多酚類化合物，常作為抗氧化活性物質(zhì)被添加到保健食品中，能夠顯著降低癌癥、心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，此外還對口腔潰瘍有一定的治愈效果。本文對柚皮苷的最佳提取條件進(jìn)行研究，為柚子皮中柚皮苷更好的加工提供理論依據(jù)，以期找出更好的提取方法，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

白柚，產(chǎn)自于四川攀枝花；甲醇（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司），色譜純；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（南京道斯夫生物科技有限公司），純度99%；氫氧化鈉，分析純。

KQ-500E型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；GLC-2型不銹鋼溶液真空過濾器，北京國環(huán)高科自動(dòng)化技術(shù)研究院；UVmini-1285型紫外分光光度計(jì)，島津企業(yè)管理有有限公司；TGF-9245A型鼓風(fēng)干燥箱，上海喆圖科學(xué)儀器有限公司；CA-CN水系混合纖維微孔濾膜（圓孔直徑：0.22 μm）；小型藥材粉碎機(jī)；65目藥典篩；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋；LC-4010型低速離心機(jī)。

1.2 樣品預(yù)處理與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.2.1 樣品的預(yù)處理

將實(shí)驗(yàn)用柚子的外層柚子皮剝出洗凈，將部分柚子皮分割成外表皮和內(nèi)表皮，還有部分柚子皮不做處理，將外表皮、內(nèi)表皮和不做處理的整皮分別放入鼓風(fēng)干燥箱置于50 ℃環(huán)境下干燥2.5 h，待干燥完畢后分別取出，放入小型藥材粉碎機(jī)中粉碎，將粉碎后的柚子皮過65目藥典篩，篩下的3種樣品置于干燥箱中于65 ℃環(huán)境下繼續(xù)干燥1.5 h，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

將純度為99%的柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品密封置于65 ℃干燥箱中干燥1 h，取出準(zhǔn)確稱量柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品22.3 mg，置于100 mL容量瓶中，倒入甲醇（色譜純）定容，得到223 mg·L-1的柚皮苷對照品溶液。

1.2.3 最大吸收波長的測定

精確稱量1 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL比色管中，加入0.5 mL 10%的氫氧化鈉溶液，充分搖勻、靜置后顯色7 min，用甲醇定容至刻度線，搖勻，倒入比色皿，掃描得柚皮苷最大吸收波長為420 nm。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用移液管準(zhǔn)確量取體積分別為0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各自置于25 mL比色管中，加入0.5 mL 10%的氫氧化鈉溶液，搖勻靜置7 min后以甲醇（色譜純）定容至刻度線，將5種標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于紫外線分光光度計(jì)中測定，吸收波長設(shè)為420 nm，參比溶液為甲醇，依次測定不同標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度數(shù)據(jù)，利用回歸曲線擬合，數(shù)據(jù)處理后得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1[4]。

圖1 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)步驟

準(zhǔn)確稱量0.05 g預(yù)處理的柚子皮粉末于50 mL錐形瓶中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)60%的甲醇，于65 ℃恒溫水浴鍋中水浴加熱1.5 h后放入超聲波清洗儀中超聲15 min，稍后靜置放冷至室溫，以3 000 r·min-1離心5 min，經(jīng)真空抽濾裝置過濾得到待測液，準(zhǔn)確稱取1 mL待測液，加入0.5 mL 10%的氫氧化鈉置于10 mL比色管中顯色7 min，用甲醇定容至刻度線后搖勻，利用分光光度計(jì)測定柚皮苷濃度含量，通過改變實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)而得到不同條件下柚皮苷提取率[5]。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究不同水浴溫度（40～75 ℃）、加堿量（0.3～0.7 mL）、超聲時(shí)間（5～25 min)和甲醇體積分?jǐn)?shù)（40%～80%）4個(gè)因素對柚皮中柚皮苷提取的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)5因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 柚皮苷提取工藝研究正交因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 水浴溫度對柚皮苷浸出率的影響

設(shè)置水浴溫度分別為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃和75 ℃，水浴時(shí)間為1.5 h，甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲時(shí)間15 min，加堿量0.5 mL，利用分光光度計(jì)測定8份樣品處于不同溫度水浴條件下的柚皮苷浸出率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，從圖2結(jié)果可知，水浴溫度為65 ℃時(shí)柚皮苷浸出率最高。

圖2 水浴溫度對柚皮苷浸出率的影響圖

2.1.2 超聲時(shí)間對柚皮苷浸出率的影響

設(shè)置水浴溫度為65 ℃，水浴時(shí)間為1.5 h，甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲時(shí)間分別為5 min、10 min、15 min、20 min和25 min，加堿量為0.5 mL，利用分光光度計(jì)測定不同超聲時(shí)間下的柚皮苷浸出率，將所得數(shù)據(jù)繪成圖3。根據(jù)圖3可知，柚皮苷在超聲時(shí)間15 min時(shí)取得最高浸出率。

圖3 超聲時(shí)間對柚皮苷浸出率的影響圖

2.1.3 加堿量對柚皮苷浸出率的影響

設(shè)置水浴溫度為65 ℃，水浴時(shí)間為1.5 h，甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲時(shí)間為15 min，加堿量分別為0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL和0.7 mL，利用分光光度計(jì)測定加入不同堿含量的柚皮苷浸出率，繪制圖4。由圖4可知，加堿量為0.5 mL時(shí)，柚皮苷提取率最高。

圖4 氫氧化鈉加入量對柚皮苷浸出率的影響圖

2.1.4 甲醇體積分?jǐn)?shù)對柚皮苷浸出率的影響

設(shè)置水浴溫度為65 ℃，水浴時(shí)間為1.5 h，甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%和80%，超聲時(shí)間為15 min，加堿量為0.5 mL，利用分光光度計(jì)測定處于不同體積分?jǐn)?shù)甲醇條件下的柚皮苷浸出率，結(jié)果見圖5。由圖5分析可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)在60%時(shí)，柚皮苷浸出率最高。

圖5 不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇對柚皮苷浸出率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

對正交實(shí)驗(yàn)18組數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行匯總，見表2，通過比較表2中k值和R值得到最佳提取條件為A2B2C3D3E2，柚皮苷浸出率影響因素依次為E＞D＞A＞C＞B，甲醇體積分?jǐn)?shù)對柚子皮的浸出提取有明顯影響，其次是超聲時(shí)間長短對浸出率也會產(chǎn)生較大影響，水浴溫度和加堿量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，可能是在55 ℃左右柚皮苷基本進(jìn)入甲醇溶液中，氫氧化鈉是顯色劑，堿性環(huán)境對柚皮苷穩(wěn)定存在影響不大，因此兩者不會顯著改變柚皮苷的提取率[6]。

表2 柚皮苷提取工藝研究正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（L18(35)）

此外，在設(shè)置的18個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)在A1B1C3D3E2實(shí)驗(yàn)條件下提取率最高，達(dá)到了5.96%，與由k值得到的最優(yōu)組合不一致，需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.3 最優(yōu)條件驗(yàn)證

根據(jù)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，按照A2B2C3D3E2和A1B1C3D3E2兩種工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，分別測定柚皮苷在兩種條件下的提取率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件各進(jìn)行3次重復(fù)，見表3。實(shí)驗(yàn)表明，處于A2B2C3D3E2條件下的柚皮苷提取率達(dá)到6.24%，高于A1B1C3D3E2條件下的提取率，因此得出最優(yōu)條件為A2B2C3D3E2，該條件下工藝穩(wěn)定可行，且重復(fù)性良好。

表3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié)論

柚皮苷提取方法有很多，常見的有堿提酸沉法、微波提取法、有機(jī)溶劑萃取法[3]。本文采用的方法在傳統(tǒng)有機(jī)溶劑萃取法上有所改進(jìn)，利用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取的工藝，通過控制變量單因素實(shí)驗(yàn)和5水平3因素正交實(shí)驗(yàn)對不同部位的柚皮苷最佳提取條件進(jìn)行了研究，得到了最佳的提取工藝條件為柚子皮選用外表皮，氫氧化鈉0.5 mL，甲醇體積分?jǐn)?shù)60%，水浴溫度65 ℃，超聲時(shí)間15 min。利用本工藝提取柚皮苷具有效率高、選擇性強(qiáng)、方便簡單等優(yōu)點(diǎn)，為下一步高純度柚皮苷提取工業(yè)化提供了思路。