熒光假單胞菌快速檢測方法優化及在鴨肉中的檢測效果評價

王雨涵，程家耕，張 毅，韓千慧，周 敏，侯溫甫

（武漢輕工大學 食品科學與工程學院，湖北武漢 430023）

鴨肉作為中國歷史悠久的肉類食材，深受消費者青睞，但其品質易受到微生物尤其是優勢腐敗菌的影響[1-3]。白衛東等[4]對鴨腿中的菌群結構進行了測定，發現假單胞菌在冷藏末期成為了主要的腐敗菌。吳忌等[5]通過研究發現鴨腿中腐敗微生物組成復雜多樣，其中假單胞菌是優勢腐敗菌，豐度高達93.69%。因為腐敗能力強，對鴨肉的品質以及新鮮度會造成影響，所以假單胞菌是評價鴨肉品質的一個重要指標。

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）屬于革蘭氏陰性菌，在低溫條件下也能生長，具有嗜冷特性，廣泛存在于自然環境中，具有條件致病性。在低溫貯存條件下，假單胞菌會在牛奶等高蛋白食物的食品原料中大量繁殖，迅速成為優勢腐敗菌。假單胞菌不僅會導致食品腐敗變質，且有研究發現熒光假單胞菌在生長代謝過程中會產生多種溶血內毒素，進入人體血液中會導致嚴重休克。雖然由熒光假單胞菌導致的食品中毒事件還未見報道，但隨著人們飲食習慣的改變和冷鏈物流體系的快速發展，假單胞菌對人體健康的潛在危害不容忽視。

生鮮肉的腐敗主要起因于環境中的致腐微生物，而熒光假單胞菌是冷鮮鴨肉中重要的優勢腐敗菌，對其進行檢測對保證冷鮮鴨肉的鮮度和安全性具有重要意義。本研究以冷鮮鴨肉中的熒光假單胞菌為研究對象，優化了熒光假單胞菌的快速檢測方法，并對實際應用效果進行評估，以期以更加方便快捷的方法實現對冷鮮鴨肉中熒光假單胞菌的快速檢測，及早掌握食品中腐敗菌的變化，進而快速評估食品質量與安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所涉及菌株中，4株假單胞菌標準株（銅綠假單胞菌ASI.1129、惡臭假單胞菌ATCC 14909、產堿假單胞菌ATCC 17485和熒光假單胞菌ATCC 17397）購于廣東省微生物研究所，其余菌株均來源于武漢輕工大學食品科學與工程學院生鮮食品加工與安全團隊實驗室，為實驗室前期從鴨肉中分離所得。CFC假單胞菌選擇性培養基、MRS瓊脂培養基、STAA培養基、氣單胞菌培養基和腸道菌計數瓊脂培養基（青島海博生物技術有限公司）；Probe qPCR Mix、MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（大連寶生物工程有限公司）；TaKara細菌DNA提取試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅公司）；DRP-9082型電熱恒溫培養箱（上海森信公司）；CFX96Touch熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化公司）；HBM-400D系列樣品均質器（天津恒奧公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 熒光定量PCR引物和探針的設計

選擇gyrB基因為檢測的基因靶點，參考楊一林[6]的相關研究設計合成了PCR引物及相應的TaqMan探針。

1.3.2 細菌培養和DNA的提取

將熒光假單胞菌株ATCC 17397劃線接種于CFC假單胞菌選擇性培養基后置于30 ℃培養箱中，于30 ℃下培養36～48 h，將平板上的單菌落挑入10 mL LB液體培養液中，于30 ℃下搖動培養16 h，獲得種子液，待用。參照TaKara細菌DNA提取試劑盒的使用說明對60株細菌的DNA進行提取，-20 ℃保存待用。

變型式模塊創建模式充分利用現有的設計知識和設計成果,最大限度地利用現有的模塊進行變型設計,創建出符合要求的新模塊,基于實例的推理技術、基于變量參數的變型設計理論是該模式的理論基礎和根本依據.核心環節為模塊推理、模塊特征參數檢索和模塊變型設計.

1.3.3 熒光定量PCR體系的建立與條件優化

采用20 μL體系進行PCR擴增，即Probe q PCR Mix（2X）12.5 μL、Probe（10 μM）1 μL、dd H2O 6.2 μL、上下游引物各0.4 μL及模板DNA 2 μL。

在引物設計軟件推薦Tm值（56.6 ℃）附近設置10個溫度梯度（53～62 ℃），對退火溫度進行優化。根據試劑說明書，設置6個探針濃度，對添加的引物濃度進行優化。根據上述設置的條件進行PCR擴增，測定相應的Cq值，每組樣品重復測定3次，結果取平均值。

1.3.4 熒光定量PCR特異性驗證

選擇來源于鴨肉中的60株供試菌進行特異性驗證，將60株供試菌的DNA用優化后的參數進行PCR擴增，以無菌水作為空白對照。結果若擴增循環數（Cq值）小于35，則結果為假陽性。

1.3.5 熒光定量PCR標準曲線的構建及擴增效率

選用純培養和人工接種兩種方法測定熒光定量PCR反應的標準曲線。采用計數結果和熒光定量PCR輸出的Cq值分別為橫坐標和縱坐標，建立純培養和人工接種兩種方法的標準曲線，并用E=10-1/Slope-1計算熒光PCR反應的擴增效率。

1.3.6 熒光定量PCR最低檢出限（LOD）的評估

將熒光假單胞菌培養到109CFU·mL-1，再用無菌生理鹽水按比例稀釋，獲得T1（10 CFU·g-1）、T2（102CFU·g-1）、T3（103CFU·g-1）和T4（104CFU·g-1）的菌液。在無菌操作臺中將生鮮鴨肉置于上述4種不同濃度的菌液浸泡30 min，瀝干水分，靜置20 min。取上述4組接種不同濃度假單胞菌的鴨肉樣品，用熒光定量PCR技術進行PCR檢測，獲得相應的Cq值。同時，對鴨肉樣品的菌落總數進行測定。設置3個樣品平行，結果取平均值。

1.3.7 熒光定量PCR檢測體系在實際樣品中的應用

取鴨胸肉，隨機分為兩組。減菌組用50 mg·L-1二氧化氯浸泡5 min，以冰水混合物清洗去除殘留后，瀝干。對照組鴨胸肉以冰水混合物清洗，瀝干。兩組樣品均在4 ℃貯藏條件下貯藏。從第0 d開始，每3 d進行一次取樣，進行熒光定量PCR反應，測得相應的Cq值。

1.4 數據統計方法

實驗結果用平均值±標準差的形式表達，使用IBM SPSS Statistics 25軟件進行方差分析并進行Duncan檢驗，P＜0.05表示顯著差異，使用Origin 9.0繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 熒光定量PCR反應體系建立與優化

本研究對熒光定量PCR反應體系中的退火溫度和探針濃度進行了優化，結果如圖1所示。由圖1可知，當退火溫度為60 ℃時，Cq值顯著低于其他退火溫度(P＜0.05)。在PCR反應中，退火溫度升高，可大大減少引物與模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性，但過高的退火溫度不能導致引物序列有效退火，造成假陽性。由圖2可知，隨著添加的探針濃度的升高，Cq值整體呈減小的趨 勢，當 探 針 濃 度 為600 nmol·L-1和500 nmol·L-1時，Cq值顯著低于其他探針濃度(P＜0.05)。綜上所述，優化得到的退火溫度為60 ℃，探針濃度為500 nmol·L-1。

圖1 不同退火溫度對應的Cq值

圖2 不同探針濃度對應的Cq值

2.2 熒光定量PCR特異性驗證

對60株供試菌進行特異性檢測，其中包含21個屬，有8株熒光假單胞菌，52株非熒光假單胞菌。結果表明，8株熒光假單胞菌檢測結果均為陽性，其他52株菌株中有9株出現了微弱的擴增現象，其中葡萄球菌、布丘氏菌、水拉恩氏菌、沙雷氏菌和耶爾森氏菌有一定概率出現假陽性，這可能是優化后的條件對這些菌株而言不合適，不能導致引物序列有效退火，從而造成假陽性。特異性驗證結果表明，本研究設計的引物對熒光假單胞菌檢測具有良好的特異性，可用于對熒光假單胞菌的檢測。

2.3 熒光定量PCR的標準曲線及擴增效率評價

建立以純培養和人工接種為基礎的熒光定量PCR的標準曲線。結果顯示，以純培養方法建立的PCR標準曲線為Y=-3.135X+41.328，相關系數r2為0.994，以人工接種方法建立的PCR標準曲線為Y=-3.214X+42.406，相關系數r2為0.992。兩者均具有很好的線性關系，擬合結果很好。純培養和人工接種方法建立的曲線斜率分別為-3.135和-3.214。用標準曲線對擴增效率進行計算，分別為108%和105%，擴增效率良好，與張昭寰等[7]的研究結果一致。

2.4 最低檢出限（LOD）值評估

采用4種不同污染水平的鴨胸肉，對其熒光定量PCR系統的最低檢出限進行測定，結果如表1所示，T1未檢測到熒光假單胞菌，PCR檢測結果呈現陰性；T2、T3、T4測得的熒光假單胞菌菌落數分別為2.50 lg(CFU·g-1)、3.42 lg(CFU·g-1)、4.47 lg(CFU·g-1)，PCR結果均為陽性。綜上，本研究建立的熒光定量PCR法最低檢出限為102CFU·g-1。

表1 生鮮鴨肉中熒光假單胞菌的最低檢出限（LOD）

2.5 快速檢測方法在生鮮鴨肉中的檢測效果評價

根據所構建的熒光定量PCR方法對鴨肉冷藏期間的Cq值進行測定，結果如表2所示。對照組鴨肉從第3 d開始檢測結果呈陽性，且隨著貯藏時間的延長，Cq值先趨于穩定后開始逐漸減小。減菌組生鮮鴨肉在整個貯藏期間檢測始終呈陰性。兩組鴨肉中熒光定量PCR反應輸出Cq值與實際檢測到的熒光假單胞菌的數量變化趨勢一致，當熒光假單胞菌數量達到檢出限，檢測結果呈陽性，且隨著假單胞菌數量的增加，Cq值逐漸減小。建立的熒光定量PCR檢測方法對于熒光假單胞菌污染程度不同的樣品具有良好的區分效果，可通過Cq值對生鮮鴨肉中熒光假單胞菌的數量進行定量檢測。統計從樣品處理到結果分析等整個檢測過程，用時控制在5 h以內。綜上，利用優化后的方法，檢測效率高，可有效用于鴨肉中的熒光假單胞菌的快速檢測。

表2 貯藏期間生鮮鴨肉產品中熒光假單胞菌的檢測結果表

3 結論

通過對假單胞菌快速檢測條件的優化，得到的最佳退火溫度為60 ℃和探針濃度最佳為500 nmol·L-1，所構建的熒光定量PCR方法的特異性、最低檢出限以及在實際樣品中的應用效果的評估結果表明，該方法對鴨肉中的熒光假單胞菌具有極高的特異性和良好的擴增效率，最低檢出限低至102CFU·g-1。根據檢測出的Cq值，可對假單胞菌污染程度不同的樣品進行良好的區分，且整個檢測過程時間控制在5 h以內，檢測效率高。本文為熒光假單胞菌的快速檢測提供了一種可行的方法，有利于更加準確快速地掌握假單胞菌的生長或動態變化，保障冷鮮鴨肉在生產加工環節的質量與安全性。