UPLC-MS/MS法測定牛蛙中呋喃唑酮代謝物的不確定度評定

陳 茹，孫 藝，陳曉嘉，陳年華

（1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442；2.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站，廣東廣州 511442；3.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442）

測量不確定度是用來表征賦予被測變量的值的分散程度的參數(shù)，是判斷測量結(jié)果的依據(jù)和評定測量水平的指標(biāo)[1]。為了確保呋喃唑酮的代謝物-3-氨基-2-噁唑烷基酮檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)相關(guān)認(rèn)可技術(shù)規(guī)范[2]要求進(jìn)行測量不確定度評定。根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL006：2019）[3]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[4]等相關(guān)技術(shù)規(guī)范規(guī)定，對使用農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留量過程中可能產(chǎn)生的不確定度因素進(jìn)行分析評定，并得到最終檢測結(jié)果的不確定度[5-7]。本文以農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006為檢測方法，分析和評定牛蛙中呋喃唑酮代謝物殘留量檢測過程中可能影響檢測結(jié)果的不確定度因素，以確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性，進(jìn)而提高檢測結(jié)果的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

牛蛙采購于市場。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品及試劑

呋喃唑酮代謝物AOZ；呋喃唑酮代謝物內(nèi)標(biāo)物AOZ-D4；甲醇；醋酸銨；二甲亞砜；2-硝基苯甲醛；磷酸氫二鉀；乙酸乙酯；濃鹽酸；超純水，Milli-Q公司。

1.3 儀器及設(shè)備

AB Sciex Triple Quad 4500超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源；電子天平；渦旋振蕩器；恒溫振蕩器；離心機(jī)；氮吹儀；pH計。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品處理

樣品牛蛙按照標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006進(jìn)行樣品處理。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）AOZ標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 017 μg·mL-1）配制。準(zhǔn)確稱取0.025 50 g AOZ于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。

（2）AOZ標(biāo) 準(zhǔn) 中 間 液 配 制。移 取0.10 mL 1 017 μg·mL-1AOZ標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到10.17 μg·mL-1AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取0.10 mL 10.17 μg·mL-1AOZ標(biāo) 準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到101.7 ng·mL-1的AOZ標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（3）AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)儲備液（150 μg·mL-1）配制。準(zhǔn)確稱取0.001 51 g AOZ-D4于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容至刻度。

（4）AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)中間液配制。移取0.07 mL 150 μg·mL-1AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到1.05 μg·mL-1AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取1 mL 1.05 μg·mL-1AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到105 ng·mL-1的AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（5）AOZ標(biāo) 準(zhǔn) 工 作 液 配 制。分 別 準(zhǔn) 確 移取 濃 度 為101.7 ng·mL-1的AOZ標(biāo) 準(zhǔn) 中 間 液0.05 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL和1.00 mL以 及0.50 mL 105 ng·mL-1AOZ-D4標(biāo) 準(zhǔn) 中 間 液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。分別得到AOZ標(biāo) 準(zhǔn) 工 作 液 濃 度 為0.508 5 ng·mL-1、1.017 0 ng·mL-1、2.542 0 ng·mL-1、5.085 0 ng·mL-1和10.170 0 ng·mL-1，AOZ-D4濃度為5.25 ng·mL-1。

1.4.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：C18液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2.0 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫：0～0.5 min，10%B；0.5～6.0 min，10%B～90%B；6.0～7.0 min，90%B；7.00～7.01 min，90%B～10%B；7.01～8.00 min，10%B。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測模式；氣簾氣為30 psi；碰撞氣為9 psi；離子化電壓為5 500 V；溫度為550 ℃；噴霧氣為55 psi；輔助加熱氣為55 psi；定量離子：AOZ為236.1/133.9，AOZ-D4為240.1/134.0；定 性 離 子：AOZ為236.1/104.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型建立

超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定試樣中AOZ殘留量的計算公式為

式中：X為樣品中AOZ的含量，μg·kg-1；Ci為樣品制備液中AOZ的濃度，ng·mL-1；V為樣液最終定容體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g；R3為加標(biāo)回收率，%。

2.2 不確定度的來源

應(yīng)用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定牛蛙中AOZ殘留量的不確定度，不確定度主要來源于AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、重復(fù)測定樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品前處理、加標(biāo)回收率以及檢測設(shè)備，詳見圖1。

圖1 UPLC-MS/MS法測定牛蛙中AOZ的不確定度來源

2.3 各不確定度結(jié)果分析

2.3.1 配制AOZ標(biāo)準(zhǔn)儲備液產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(標(biāo))

（1）AOZ標(biāo)準(zhǔn)品純度引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(P)。由AOZ標(biāo)準(zhǔn)品證書可知，其擴(kuò)展不確定度為1.01%（k=2），純度為99.71%，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）稱量AOZ標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)。由十萬分之一電子天平檢定證書可知，最大允許誤差MPE為±0.05 mg，根據(jù)均勻分布稱取0.025 50 g AOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)為

（3）AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程量器產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1)。25 mL、10 mL A級容量瓶最大容量允差分別為±0.03 mL和±0.020 mL，200 μL移 液 槍 最 大 允 差 為±3.0 μL，按均勻分布，則配制AOZ儲備液使用25 mL容量瓶產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V2)為6.93×10-4。使用10 mL容量瓶和200 μL移液槍配制AOZ標(biāo)準(zhǔn)中間液產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V3)、urel(V4)分別為

1.15×10-3、8.66×10-3。

AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程量器產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1)為

（4）溫度變化引起溶劑體積變化的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(T1)。假設(shè)溫度變化為±4 ℃，AOZ的儲備液及中間溶液的溶劑為甲醇，甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按均勻分布，25 mL容量瓶、10 mL容量瓶和200 μL移液槍引起甲醇產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(T2)、urel(T3)和urel(T4)均為2.75×10-3。則配制AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液溫度變化引起溶劑產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(T1)為

2.3.2 AOZ標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(曲)

（1）配制AOZ標(biāo)準(zhǔn)工作溶液所用量器引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V5)。按均勻分布，10 mL容量瓶引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V6)為1.15×10-3；1 000 μL移液槍和200 μL移液槍引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V7)和urel(V8)均為5.77×10-3；使用1 000 μL移液槍移取AOZ-D4溶液引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(內(nèi))為5.77×10-3。則配制AOZ標(biāo)準(zhǔn)工作溶液所用量器產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V5)為

（2）溫度變化引起溶劑體積變化產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(T5)。假設(shè)溫度變化為±4 ℃，AOZ標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的溶劑為水，AOZ-D4溶液的溶劑為甲醇，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按均勻分布，1 000 μL移液槍、200 μL移液槍、10 mL容量瓶引起體積變化產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(T6)、urel(T7)和urel(T8)均 為4.85×10-4。1 000 μL移 液 槍移取AOZ-D4溶液引起的體積相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(T2內(nèi))為2.75×10-3。則配制AOZ標(biāo)準(zhǔn)工作溶液溫度變化引起所用量器產(chǎn)生的體積相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(T5)為

AOZ標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(曲)為1.15×10-4。則配制AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的標(biāo)準(zhǔn)品、天平、量器、溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(標(biāo))為

2.3.3 重復(fù)測定樣品產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

稱取6份陽性樣品，經(jīng)前處理步驟處理后，AOZ測定結(jié)果分別為8.301 ng·mL-1、7.845 ng·mL-1、7.930 ng·mL-1、8.450 ng·mL-1、8.178 ng·mL-1和7.829 ng·mL-1，平均結(jié)果為8.089 ng·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)差為8.298×10-3ng·mL-1，則重復(fù)測定樣品結(jié)果產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u2

rel(X)=1.05×10-6。

2.3.4 AOZ標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

urel(D)

AOZ標(biāo)準(zhǔn)曲線測定3次，以AOZ標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度（X）為坐標(biāo)，AOZ標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度面積及其AOZ-D4峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，最小二乘法擬合得到一元回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 AOZ標(biāo)準(zhǔn)曲線測定3次的結(jié)果

AOZ線性回歸方程為y=0.232 3x+0.047 8，相關(guān)系數(shù)為r=0.999 9。標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)差SR的計算公式為

式中：yij為各標(biāo)點(diǎn)峰面積比值；yi為回歸直線值；n為標(biāo)點(diǎn)數(shù)，n=5；m為每標(biāo)點(diǎn)重復(fù)測定次數(shù)，m=3。

則殘差y產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(y)為

回歸線性斜率a的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(a)為

回歸線性截距b的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(b)為

則AOZ標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(D)為

則AOZ標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(D)為

urel(D)=1.37×10-4

2.3.5 樣品處理過程中產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

urel(Q）

（1）樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)。根據(jù)電子天平檢定證書，稱量范圍在0～50 000 mg時，天平示值最大允差為0.5 mg，校準(zhǔn)砝碼產(chǎn)生的不確定度非常小，忽略不計，按均勻分布，稱量樣品質(zhì)量為2.000 g，樣品稱量產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)為1.44×10-4。

（2）前處理過程中所用移液器產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V9)。樣品前處理過程中使用1 000 μL移液槍移取1 000 μL定容溶液，按均勻分布，則移液槍產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V9)為5.77×10-3。

（3）溫度變化T引起溶劑體積變化產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V9)。樣品的定容溶液的主要成分為水，按均勻分布，使用1 000 μL移液槍溫度變化引起水產(chǎn)生的體積相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V9)為4.85×10-4。

則前處理過程中產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Q)為

2.3.6 加標(biāo)回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

urel(R3)

在牛蛙樣品中加入4.0 μg·kg-1的AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行6次加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，計算回收率。按照矩形分布，樣品加標(biāo)回收率結(jié)果及其引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表2。樣品加標(biāo)回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算公式為

表2 樣品加標(biāo)回收率結(jié)果及其引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度（n=6）

式中：urel(R)為加標(biāo)回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；為平均回收率，%；S為回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差，%；

2.3.7 檢測設(shè)備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(B)

根據(jù)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀證書，儀器相對擴(kuò)展不確定度Urel為6%（k=2），則檢測設(shè)備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(B)為0.03。

2.3.8 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel

2.3.9 擴(kuò)展不確定度評定

取置信水平p=95%，包含因子k=2，待檢測樣品AOZ含量為3.95 μg·kg-1，則其擴(kuò)展不確定度為

U=2×3.95×4.23%=0.33 μg·kg-1

3 結(jié)論

本文對使用農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006中液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定牛蛙中的AOZ殘留量的不確定度進(jìn)行分析和評定，根據(jù)測量不確定度的評定規(guī)范，建立數(shù)學(xué)模型，對測定AOZ殘留量過程中的各不確定度分量進(jìn)行評定和計算，得到擴(kuò)展不確定。結(jié)果顯示，測定牛蛙中AOZ殘留量的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、加標(biāo)回收率、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及儀器設(shè)備。因而，在檢測過程中，應(yīng)盡量選用精度較高的移液器和玻璃量器，規(guī)范配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線，適當(dāng)增加平行樣品次數(shù)，同時確保儀器設(shè)備狀態(tài)良好，可最大程度降低不確定度，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。