液態乳制品中乳清蛋白和酪蛋白含量分析

孔凡華，趙笑，李宏，白沙沙，楊春雪，孫曉辰，富宏坤，侯君釗，崔亞娟*

1(北京市營養源研究所有限公司，北京，100069)2(中國合格評定國家認可中心，北京，100062)3(北京聯合大學 自動化學院，北京，100101)

乳及乳制品是人體重要的蛋白質來源，乳蛋白是牛乳中最有營養價值的部分。牛乳中約含有2.2%～4.4%的蛋白質，主要包括乳清蛋白、酪蛋白及少量脂肪球膜蛋白等[1]。乳清蛋白由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、糖肽、牛血清白蛋白和次要蛋白(如乳過氧化物酶、溶菌酶、骨橋蛋白和乳鐵蛋白)組成[2]。乳清蛋白具有重要的營養價值和生物學效價[3]，是公認的人體優質蛋白質補充劑之一。β-乳球蛋白是由乳腺上皮細胞合成的乳特有蛋白質，約占乳清蛋白總量的50%[4]。β-乳球蛋白具備最佳的氨基酸比例，支鏈氨基酸含量極高，有降低膽固醇、抗氧化、易被吸收、促進脂溶性營養素(如維生素A和維生素E)吸收等作用[5-6]，被認為是多功能蛋白。α-乳白蛋白占牛乳清蛋白的20%左右，作為輔酶參與乳糖的生物合成[3]，是泌乳階段的一個重要調節因子，也是必需氨基酸色氨酸和半胱氨酸的良好供體[7]。乳鐵蛋白是乳清蛋白中的一種重要的非血紅素鐵結合糖蛋白，具有獨特的結構和生物學功能，在強化機體鐵吸收、對抗病原體、免疫調節及抗氧化等方面發揮著重要的作用[8-10]。骨橋蛋白是一種多功能磷酸化糖蛋白，參與細胞遷移、生存、炎癥反應和腫瘤轉移等生理活動[11]。骨橋蛋白也是心室重塑過程中的重要糖蛋白，它通過影響炎癥反應，調節細胞外基質表達及腎素—血管緊張素—醛固酮系統，可進一步影響心室重塑[12-13]。酪蛋白是乳中含量最高的蛋白質[14]，約占牛乳蛋白含量的76%～86%，是由乳腺上皮細胞合成的一種含有大量鈣和磷的蛋白，以膠束形式存在于牛乳中[15]。牛乳含有4種酪蛋白，分別為αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白[16]。酪蛋白中包含多種人體必需的氨基酸，水解后可產生血管緊張素轉移酶抑制肽、抗氧化肽、抗疲勞肽等功能肽段[17]，同時，可以促進Ca2+、Zn2+等離子吸收[18]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

市售風味發酵乳和風味酸乳共計13種，分別為A品牌炭燒風味發酵乳、B品牌益菌多風味發酵乳(原味)、C品牌炭燒風味發酵乳(黃桃口味)、H品牌益生菌酸牛奶、I品牌原味酸牛奶、J品牌復原乳風味發酵乳、B品牌風味酸牛奶、B品牌風味酸牛奶(原味)、C品牌復原乳風味酸牛奶(原味)、D品牌老酸奶風味酸牛奶、G品牌濃縮酸奶、G品牌熟酸奶和H品牌罐酸奶；其他液態乳共計15種，分別為B品牌鮮牛乳、C品牌鮮牛奶、E品牌純牛奶、B品牌脫脂鮮牛奶、A品牌純牛奶、A品牌優選純牛奶、C品牌純牛奶、D品牌純牛奶、E品牌牛乳、F品牌純牛奶、F品牌100%純牛奶、D品牌悅鮮活牛奶、K品牌奶糖風味牛奶、L品牌山羊奶、M品牌純羊奶。液態乳樣品采集后4 ℃保存，3 d內測定。

1.2 試劑與儀器

NH4HCO3、CaCl2、乙酸、H2SO4、NaOH(均為分析純)，北京化工廠；甲酸、乙腈(均為色譜純)，賽默飛世爾科技有限公司；二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘代乙酰胺(iodoacetamide，IAA)，北京索萊寶科技有限公司；牛胰蛋白酶，美國Sigma公司；特異肽段(純度≥95%)，寧波康貝生化有限公司。

UPLC I-CLASS XEVO液相色譜-串聯三重四級桿質譜聯用儀(帶電噴霧離子源)，美國Waters公司；BS224S分析天平，德國賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；QL-901旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ZHWY-110X30往復式恒溫水浴搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；PS-60A超聲波振蕩器，深圳市深華泰實業有限公司；KJ2300全自動凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

稱取液態試樣10 g于100 mL容量瓶中，加90 mL水充分溶解后定容至刻度，旋渦混合器混合樣品。移取1.0 mL上述試樣，用水定容至10 mL，經旋渦混合器混合均勻。移取混勻后的試樣溶液200 μL于2 mL離心管中，加入150 μL 500 mmol/L NH4HCO3溶液和10 μL 500 mmol/L DTT溶液，混勻后置于75 ℃恒溫水浴30 min；冷卻至室溫，加入30 μL 500 mmol/L IAA溶液，暗處靜置30 min；再加入10 μL 100 mmol/L CaCl2溶液和50 μL 500 μg/L牛胰蛋白酶溶液，充分混勻后置于37 ℃恒溫水浴中酶解5 h。胰蛋白酶可特異性的酶切賴氨酸和精氨酸位點，生成多條乳蛋白肽段。酶解后向樣液中加10 μL甲酸混勻，室溫下靜置15 min，加入490 μL水，渦旋混勻后，用0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜串聯質譜儀檢測[19]。

1.3.2 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC 300 Protein BEHC4色譜柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃，進樣量5 μL，流速0.3 mL/min。

流動相A為0.1%(體積分數，下同)甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，進行梯度洗脫。梯度洗脫程序如下：0～1.5 min，5% B；1.5～2.5 min，5%～38% B；2.5～6.5 min，38%～41% B；6.5～7.6 min，41%～95% B；7.6～8.0 min，保持95% B；8.0～8.1 min，95%～5% B；8.1～10.0 min，5% B[20]。

1.3.3 質譜條件

毛細管電壓3.5 kV，錐孔電壓35 kV，脫溶劑溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L/min，錐孔反吹氣流量30 L/h，碰撞室壓力0.3 Pa，低端分辨率1∶2.5 V，高端分辨率1∶15.0 V，離子能量1∶0.5，離子源溫度150 ℃，提取器壓力3.0 V，入口透鏡電壓0.5 V，碰撞梯度1.0。

α-乳白蛋白分子質量為14 178 Da、β-乳球蛋白分子質量為18 320 Da、骨橋蛋白分子質量為44 000 Da、乳鐵蛋白分子質量為76 095.1 Da、αs1-酪蛋白分子質量為23 614 Da、αs2-酪蛋白分子質量為25 230 Da、β-酪蛋白分子質量為23 983 Da、κ-酪蛋白分子質量為19 023 Da，采用特異肽段外標法定量。乳清蛋白和酪蛋白特異肽段譜圖見圖1。

1.4 計算公式

試樣中乳清蛋白含量按照公式(1)計算：

ww=(wα+wβ)/F

(1)

式中：ww，試樣中乳清蛋白的含量，g/100 g；wα，試樣中α-乳白蛋白的含量，g/100 g；wβ，試樣中β-乳球蛋白的含量，g/100 g；F，折算系數，取值0.6。

1.5 數據處理

實驗收集到的原始數據經過Excel 2016和SPSS 2.0整理分析。

2 結果與分析

本文采用酶解法同時測定液態乳制品中乳清蛋白和酪蛋白的含量，由表1知，在風味發酵乳和風味酸乳中，α-乳白蛋白含量在49～195 mg/100 g，含量最高的為J品牌復原乳風味發酵乳，含量最低為C品牌炭燒風味發酵乳。β-乳球蛋白含量在108～441 mg/100 g，含量最高的為J品牌復原乳風味發酵乳，含量最低為C品牌炭燒風味發酵乳。骨橋蛋白含量在1.33～3.53 mg/100 g，含量最高的為J品牌復原乳風味發酵乳，含量最低為C品牌復原乳風味酸牛奶。乳鐵蛋白含量在0.062～0.342 mg/100 g，含量最高的為B品牌風味酸牛奶，含量最低為D品牌老酸奶風味酸牛奶。乳清蛋白含量在261～1 060 mg/100 g，含量最高的為J品牌復原乳風味發酵乳，含量最低為C品牌炭燒風味發酵乳。

a-α-乳白蛋白；b-β-乳球蛋白；c-骨橋蛋白；d-乳鐵蛋白；e-αs1-酪蛋白；f-αs2-酪蛋白；g-β-酪蛋白；h-κ-酪蛋白圖1 乳清蛋白和酪蛋白特異肽段譜圖Fig.1 Whey protein and casein specific peptide segment spectrum

鮮牛奶和純牛奶中α-乳白蛋白含量在90～179 mg/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風味牛奶，此樣品為調制乳。β-乳球蛋白含量在199～343 mg/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風味牛奶，此樣品為調制乳。骨橋蛋白含量在3.11～5.72 mg/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風味牛奶，此樣品為調制乳。乳鐵蛋白含量在0.039～7.845 mg/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為A品牌優選純牛奶，此樣品為高溫殺菌乳。乳清蛋白含量在486～833 mg/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風味牛奶，此樣品為調制乳。液態乳中酪蛋白主要是β-酪蛋白和αs1-酪蛋白，β-酪蛋白含量整體高于αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白含量相近。鮮牛奶和純牛奶中4種酪蛋白的含量整體高于風味發酵乳和風味酸乳。在風味發酵乳和風味酸乳中，αs1-酪蛋白含量為0.516～0.968 g/100 g，含量最高的為B品牌益菌多風味發酵乳，含量最低為G品牌熟酸奶。αs2-酪蛋白含量在0.047～0.206 g/100 g，含量最高的為B品牌益菌多風味發酵乳，含量最低為G品牌熟酸奶。β-酪蛋白含量在0.44～1.07 g/100 g，含量最高的為B品牌益菌多風味發酵乳，含量最低為G品牌熟酸奶。κ-酪蛋白含量在0.082～0.298 g/100 g，含量最高的為B品牌益菌多風味發酵乳，含量最低為G品牌熟酸奶。鮮牛奶和純牛奶中，αs1-酪蛋白含量在0.874～1.083 g/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風味牛奶，此樣品為調制乳。αs2-酪蛋白含量在0.17～0.234 g/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風味牛奶，此樣品為調制乳。β-酪蛋白含量在0.955～1.20 g/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風味牛奶，此樣品為調制乳。液態羊乳中各種功能蛋白的含量和液態牛乳相近。

風味發酵乳和風味酸乳中，B品牌益菌多風味發酵乳和J品牌復原乳風味發酵乳中功能蛋白含量較高，C品牌炭燒風味發酵乳功能蛋白含量較低。鮮牛奶和純牛奶中，E品牌牛乳(高溫殺菌乳)功能蛋白含量較高，K品牌奶糖風味牛奶(調制乳)功能蛋白含量較低。

3 結論與討論

28種液態乳制品中，乳清蛋白主要是β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，β-乳球蛋白含量整體高于α-乳白蛋白，同時，含有少量的骨橋蛋白和乳鐵蛋白。酪蛋白的含量普遍大于乳清蛋白，其中，αs1酪蛋白和β-酪蛋白占比為最高的2種酪蛋白。鮮牛奶和純牛奶中乳清蛋白和酪蛋白的含量整體高于風味發酵乳和風味酸乳。

28種液態乳制品中，乳清蛋白和酪蛋白含量差異非常顯著，這是因為28種液態乳制品中有牛乳、羊乳、復配乳、濃縮乳等不同來源的乳品，可能直接導致了乳清蛋白和酪蛋白的差異。不同液態乳制品的加工處理方式不同，對各種功能蛋白的含量具有顯著影響。此外高溫殺菌乳、超瞬時殺菌乳貯藏時間的不同可能也會導致蛋白含量的差異性。后續研究應該側重不同乳來源、不同熱處理方式、不同保質期液態乳制品中功能蛋白含量的差異研究。