蒸汽爆破預處理對芝麻粕蛋白結構與功能特性的影響

吳甜甜，易軍鵬*，董晶寅，李欣

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471000)2(河南科技大學 化工與制藥學院，河南 洛陽，471000)

芝麻也叫油麻，是生長周期為一年的主要油料作物，我國2000～2019年芝麻的平均產量達到60.17萬t。在我國約有4/5以上的芝麻用來榨油[1]，芝麻粕是芝麻榨油后的副產物，其蛋白含量可達42.5%～47.9%，且含有多種氨基酸，不含抗營養因子[2]，其氨基酸符合聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)/世界衛生組織(World Health Organization，WHO)推薦的人體蛋白質標準，并含有30%的必需氨基酸，是一種較好的植物蛋白來源，可用作食品中的功能蛋白[3]。而熱榨后的芝麻粕中蛋白質嚴重變性，功能性質差[4]。目前針對蛋白質進行改性的方法包括化學改性、物理改性、酶法改性和基因工程改性等。化學改性使用較廣、效果好，但專一性差，有試劑殘留，安全性不高等問題；物理改性主要包括加熱、微波、機械作用等，它具有無毒副作用、高效等優點，但通常無蛋白質一級結構的改變；酶法改性容易產生苦味肽且不易在酸沉工藝中回收；基因工程改性安全性不明、時間長等[5]。

蒸汽爆破是一種綠色、經濟的物理處理方法，主要應用于植物原料的預處理，它通過高壓蒸汽對原料浸潤后瞬間泄壓，從而使原料內部蒸汽瞬間膨脹而“爆破”，使纖維斷裂、細胞破碎等。因此有利于原料纖維的降解、酶和化學物的可及性以及細胞內容物的溶出。王堃等[6]提出蒸汽爆破處理可使木質纖維原料的纖維聚合度下降，半纖維素和部分木質素降解，纖維素內氫鍵斷裂，從而使其用于乙醇生產的酶解效率提高。CARVALHO等[7]將蒸汽爆破技術用于處理富含木聚糖的甘蔗渣，與常用的步驟繁復的堿提酶解法效果相當。張燕鵬等[8]發現蒸汽爆破技術可用于解決高溫豆粕蛋白因變性導致的溶解性低的問題。那治國等[9]研究了汽爆處理后的米糠粕蛋白，發現蛋白質的提取率和功能特性都得到了提高。ZHANG等[10]研究了汽爆處理后的油茶籽蛋白質，發現在不同的pH條件下，其溶解度、起泡和乳化性能均明顯高于未處理的油茶籽蛋白。

本文選取芝麻粕蛋白作為研究對象，探討蒸汽爆破預處理對其溶解、持油、起泡和乳化性的影響。通過色差分析、氨基酸組成分析、傅立葉變換紅外(Fourier transform infrared，FTIR)光譜儀、差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)、熱重分析儀(thermal gravimetric analyzer，TGA)、熒光光譜分析等方法，考察了蒸汽爆破預處理對芝麻粕蛋白質結構與功能性質的影響，旨在為芝麻餅粕的高值化開發利用提供理論參考和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芝麻粕，河南省南陽市當地市場油坊，為未脫殼白芝麻經熱榨后的產物；非轉基因一級大豆油，中糧福臨門食品營銷有限公司；水解蛋白氨基酸標品，德國曼默博爾公司；正己烷、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、乙醇(95%)、NaOH、CuSO4、KBr、濃H2SO4、HCl等，均為分析純，天津德恩化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

QBS-80B蒸汽爆破設備，鶴壁正道生物能源有限公司；TM3030Plus掃描電鏡，日本日立高新技術公司；X-rite Color I5色差計，美國愛色麗公司；VERTEX70中紅外光譜儀，德國布魯克儀器公司；STA 2500 Regulus 熱重分析儀，德國耐馳儀器制造有限公司；Cary Eclipse熒光分光光度計，美國安捷倫科技有限公司；A300全自動氨基酸分析儀，德國曼默博爾公司；DSC1差示掃描量熱儀，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 芝麻粕蒸汽爆破預處理

將芝麻粕洗凈后，用蒸餾水浸泡12 h，然后在蒸汽壓強2.5 MPa，處理時間90 s的條件下進行蒸汽爆破處理。產物經15 ℃低溫干燥后粉碎，過60目篩，經正己烷脫脂后，置于冷風干燥機中干燥。

1.3.2 芝麻粕蛋白的制備

將脫脂芝麻粕粉按1∶10固液比(g∶mL)加入蒸餾水中，調pH值為10.0，磁力攪拌2 h。將混合物置于離心機中，8 000 r/min離心10 min。將過濾后的上清液pH值調至4.5，室溫放置1 h。再次離心，去除上清液，用蒸餾水洗滌蛋白質沉淀，重復進行3次，調pH值為7.0，4 ℃下透析48 h，凍干24 h后，得到芝麻粕蛋白樣品，密封置于4 ℃下保存。

1.3.3 芝麻粕蛋白結構表征

1.3.3.1 蛋白微觀結構分析

將未汽爆和汽爆蛋白樣品用離子濺射儀進行噴金處理，而后用掃描電鏡放大500倍觀察其微觀結構。

1.3.3.2 色澤分析

用色差計測定芝麻粕蛋白的色澤，記錄L*、a*、b*值，白度值(whiteness index,WI)按照公式(1)計算[11]。

(1)

1.3.3.3 氨基酸分析

將50 mg芝麻粕蛋白與10 mL 6 mol/L HCl溶液混合，110 ℃下水解22 h，采用A300全自動氨基酸分析儀測定氨基酸的種類和含量，疏水性Q值按照公式(2)(3)計算[12]：

(2)

Q=∑ΔQi

(3)

式中：Ai，100 g蛋白中所含i氨基酸的質量，g；Mi，i氨基酸的摩爾質量，g/mol；∑(Ai/Mi)，100 g蛋白中所含氨基酸總摩爾數，mol；Δfi，i氨基酸的疏水性值，cal/moL。

1.3.3.4 表面疏水性測定

將芝麻粕蛋白用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制成質量濃度0.06、0.08、0.1 mg/mL的溶液，各取8 mL分別加入40 μL的8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid, ANS)溶液(8.0 mmol/L ANS，用0.01 mol/L，pH為7.0的磷酸鹽緩沖液配制)，混合均勻，用熒光分光光度計在激發波長390 nm，發射波長400～600 nm，狹縫寬度均為5 nm，電壓800 V下測定其熒光強度。以芝麻粕蛋白濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，其初始斜率即為芝麻粕蛋白的表面疏水性。

1.3.3.5 中紅外光譜分析

將芝麻粕蛋白與KBr粉末以1∶100研磨壓制成薄片，在中紅外光譜4 000～400 cm-1進行掃描，并以KBr薄片作為空白對照。通過OMNIC軟件對數據進行基線校正，差譜，利用Peakfit 軟件將1 600～1 700 cm-1的譜帶擬合，計算芝麻粕蛋白二級結構相對含量。

1.3.3.6 熱性能測定

用差示掃描量熱儀對芝麻粕蛋白進行測定。取3.0 mg芝麻粕蛋白，密封條件下，在30～200 ℃加熱，掃描速度為10 ℃/min，試驗所需氣體為N2。

用熱重分析儀對芝麻粕蛋白進行測定。取7.0 mg芝麻粕蛋白樣品，在30～800 ℃加熱，升溫速度為10 ℃/min，流速為20 mL/s，試驗所需氣體為N2。

1.3.3.7 熒光光譜測定

室溫下，用熒光分光光度計測定芝麻粕蛋白糖基化熒光。用0.01 mol/L磷酸緩沖液將芝麻粕蛋白樣品稀釋為0.3 mg/mL，8 000 r/min下離心10 min。以340 nm為激發波長，在360～600 nm處進行掃描，以磷酸鹽緩沖液作為空白對照。

1.3.4 芝麻粕蛋白功能性質

1.3.4.1 溶解度測定[13]

將芝麻粕蛋白樣品以1∶100的質量比溶解分散于蒸餾水中并調pH值為7.0，室溫下攪拌2 h，而后在4 ℃，8 000 r/min下離心10 min，收集上清液。采用全自動凱氏定氮儀分別檢測樣品和上清液中的蛋白質含量。以上清液中蛋白質占樣品中蛋白質的百分比表示芝麻粕蛋白的溶解度。

1.3.4.2 持油性測定[14]

將0.1 g芝麻粕蛋白與5 mL大豆油置于預先稱好的離心管中，混合均勻。靜置0.5 h，將樣品在8 000 r/min下離心20 min，去除上清液后，稱重，根據公式(4)計算蛋白質樣品持油性：

(4)

式中：FAC，蛋白質樣品持油性；m2，離心后沉淀和離心管總質量，g；m1，離心管和蛋白樣品干重的總質量，g；m0，蛋白樣品的質量，g。

1.3.4.3 起泡性(foaming characteristic，FC)測定[15]

將0.3 g芝麻粕蛋白與30 mL蒸餾水加入到燒杯中，混合均勻，用均質機在10 000 r/min下攪拌1 min，迅速將蛋白溶液及泡沫轉移至量筒內，測量泡沫體積。靜置0.5 h后再次測量泡沫體積。蛋白樣品的FC及起泡穩定性(foaming stability，FS)按照公式(5)(6)計算：

(5)

(6)

式中：V0，蛋白溶液的體積，mL；V1，初始泡沫體積，mL；V2，靜置0.5 h后的泡沫體積，mL。

1.3.4.4 乳化性測定[16]

將0.1 g芝麻粕蛋白與0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.0)20 mL充分混勻，從中取6 mL蛋白溶液，加入2 mL大豆油，用均質機(10 000 r/min)在室溫條件下攪拌1 min。分別在0和10 min吸取125 μL乳濁液，與25 mL質量分數0.1% SDS混勻，以SDS為空白參比，測定溶液在500 nm處的吸光度A，用0 min的吸光度值表示乳化性。乳化穩定性指數(emulsion stability index，ESI)按照公式(7)計算：

(7)

式中：A0，0 min的吸光度值；A1，10 min的吸光度值；Δt為時間差，min。

1.3.5 數據處理分析

所有試驗檢測均平行測定3次。數據處理分析采用Origin 2021b和IBM SPSS 22軟件，P<0.05被認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 芝麻粕蛋白掃描電鏡結果分析

圖1-a、圖1-b分別為未汽爆和經過汽爆的芝麻粕蛋白微觀結構圖。未經蒸汽爆破處理的蛋白樣品有聚集現象，出現團狀聚合物，且具有較大片狀結構，而汽爆處理后的芝麻粕蛋白則以較小的片狀形式存在，結構變得松散，因此可看出，經過汽爆處理后提取的芝麻粕蛋白聚集程度變弱，分子間排列相對松散，由此也可解釋汽爆后蛋白樣品溶解性的提高。

a-未蒸汽爆破；b-蒸汽爆破圖1 蒸汽爆破處理對芝麻粕蛋白微觀結構的影響Fig.1 Effect of steam explosion on protein micro structure of sesame meal

2.2 芝麻粕蛋白色澤

芝麻粕富含蛋白質和碳水化合物，因此在蒸汽爆破的高溫高壓條件下，會有美拉德反應的發生，生成棕黑色物質[17]，而蛋白的顏色可以顯示美拉德反應的程度。汽爆及未汽爆處理的樣品顏色變化見表1。相對于未汽爆樣品，汽爆處理后得到的芝麻粕蛋白L*、a*、b*、WI值均下降，說明亮度降低、綠色度和藍色度增加，此外，白度值的降低表明蒸汽爆破處理后蛋白樣品發生了更大程度的美拉德反應，產生更多的棕色物質。

表1 蒸汽爆破處理對芝麻粕蛋白色澤的影響Table 1 Effect of steam explosion on color of sesame meal protein

2.3 氨基酸組成分析

由表2可知，芝麻粕蛋白中Asp、Glu、Leu、Phe、Arg含量較高，而Pro、Cys-Cys含量較低，這與之前的報道一致。其中Asp和Glu為呈鮮味氨基酸，占芝麻粕蛋白氨基酸總量的34%，因此芝麻粕蛋白可以用于生產食品工業中富含鮮味的產品。經過蒸汽爆破處理后，芝麻粕蛋白中氨基酸總量下降，可能是在汽爆過程中，較高的溫度促使芝麻粕中蛋白質與還原性糖結合發生美拉德反應，因此用于測定氨基酸含量的汽爆蛋白樣品純度降低，從而氨基酸含量降低。此外，表2顯示，未汽爆樣品、汽爆樣品的Q值分別為1 127.82、1 145.67 cal/mol，Q值的升高可能是由于汽爆使更多疏水性氨基酸暴露出來，增加了芝麻粕蛋白的疏水性。同時，蛋白的疏水性與苦味也相關聯，當Q值高于1 400 cal/mol時，蛋白具有苦味[12,18]。因此可推測，經過汽爆處理之后蛋白樣品疏水性增加，但不易使其產生苦味。

表2 蒸汽爆破處理對芝麻粕蛋白氨基酸組成、疏水性的影響Table 2 Effects of steam explosion on protein amino acid composition and hydrophobicity of sesame meal

2.4 芝麻粕蛋白表面疏水性分析

表面疏水性是一個與蛋白質結構、穩定性、脂肪結合能力相關的物理化學常數。在一個溶液體系中，表面疏水性的大小會影響蛋白質與其他物質的相互作用，例如水分子、油脂等，進而影響蛋白質的功能性質[19]。當蛋白質受到一些外部因素的影響發生變性時，其疏水性也會受到影響，如表3所示。

表3 蒸汽爆破處理對芝麻粕蛋白表面疏水性的影響Table 3 Effect of steam explosion on the surface hydrophobicity of sesame meal protein

經過蒸汽爆破處理后，芝麻粕蛋白的疏水性增加，可能由于汽爆破壞了蛋白質分子之間的疏水作用力，改變了蛋白樣品的結構，使其內部疏水基暴露出來，致使表面疏水性增加。

2.5 傅里葉變換紅外譜圖分析

圖2 蒸汽爆破處理對芝麻粕蛋白二級結構的影響Fig.2 Effect of steam explosion on protein secondary structure of sesame meal

對酰胺I進行高斯二階導數處理及譜圖曲線擬合來表示芝麻粕蛋白二級結構，根據α-螺旋(1 650～1 660 cm-1)、無規則卷曲(1 640～1 650 cm-1)、β-折疊(1 610～1 640 cm-1；1 670～1 680 cm-1)、β-轉角(1 660～1 670 cm-1；1 680～1 700 cm-1)的各子峰積分面積計算各二級結構的相對含量[21]。表4結果顯示，汽爆后酰胺I波段中β-折疊、β-轉角、無規則卷曲含量增加，α-螺旋減少，這表明蒸汽爆破使α-螺旋向β-折疊、β-轉角、無規則卷曲轉變，芝麻粕蛋白的二級結構被破壞，部分有序二級結構轉變為未折疊或無序的結構。此外，二級結構的變化表明，蒸汽爆破過程中發生了溶解和再生，導致蛋白質結構的變性。

表4 蒸汽爆破處理對芝麻粕蛋白二級結構含量的影響 單位：%

2.6 熱性能分析

DSC可測定蛋白質熱穩定性，同時也能顯示出蛋白質有序構象的變化。通過表5及圖3可知，未汽爆和汽爆處理的芝麻粕蛋白樣品的變性溫度分別為66.17和74.17 ℃，熱晗值分別為151.78和97.12 J/g。Td的升高說明蒸汽爆破處理后，蛋白樣品的熱穩定性增強，ΔH的減少說明汽爆后芝麻粕蛋白分子變得更無序。

表5 蒸汽爆破處理前后芝麻粕蛋白Td、ΔH的變化Table 5 Changes of Td, ΔH of sesame meal protein before and after steam explosion

圖3 蒸汽爆破處理對芝麻粕蛋白DSC的影響Fig.3 Effect of steam explosion on DSC of sesame meal protein

對圖4分析可知，蛋白樣品熱裂解主要分為2個階段：第一失重階段在30～100 ℃，主要是樣品中水分損失所致；第二失重階段在200～500 ℃，可能是由于高溫導致S—S、O—N、O—O鍵斷裂，從而使蛋白降解[10]，與未汽爆的蛋白樣品相比，蒸汽爆破處理后提取的蛋白具有更高的熱穩定性，這與DSC測定結果相對應，進而證實了蒸汽爆破可以提高芝麻粕蛋白的熱穩定性。

圖4 蒸汽爆破處理對芝麻粕蛋白熱重的影響Fig.4 Effect of steam explosion on thermal weight of sesame meal protein

2.7 蛋白質糖基化

熒光物質是美拉德反應的產物之一，同時它也是顏色物質的前提物[22]，因此，可通過蛋白質糖基化產物的熒光光譜圖來判斷芝麻粕蛋白美拉德反應進行的程度。通常在420～440 nm的熒光波長可表示蛋白質糖基化終產物的形成[22]。如圖5所示，相比未汽爆樣品，蒸汽爆破處理后的蛋白熒光強度下降，可能在高溫高壓條件下美拉德反應更為劇烈，使更多的熒光物質向有色物質轉變，這也與蛋白色澤分析結果相一致。

圖5 蒸汽爆破處理對芝麻粕蛋白熒光的影響Fig.5 Effect of steam explosion on protein fluorescence of sesame meal

2.8 蒸汽爆破對芝麻粕蛋白功能性質的影響

由表6可知，經過蒸汽爆破處理后，芝麻粕蛋白的溶解度提高。蒸汽爆破時，芝麻粕處于一種高壓高溫的環境，而適當的熱處理可改善蛋白質的溶解性，可能由于熱處理使蛋白樣品的結構發生改變，從而其聚集狀態發生變化。此外，在蒸汽爆破過程中，蛋白質可能與親水基團發生美拉德反應，增加了蛋白質的溶解度。

表6 蒸汽爆破處理對芝麻粕蛋白功能性質的影響Table 6 Effect of steam explosion on functional properties of sesame meal protein

如表6所示，經過蒸汽爆破處理的芝麻粕蛋白起泡性及起泡穩定性均高于未汽爆樣品。起泡性及起泡穩定性的改善可能是由于在汽爆過程中，芝麻粕蛋白分子的展開導致越來越多的疏水區域暴露出來，氨基酸測定數據表明了汽爆后蛋白疏水性的增加，中紅外光譜儀測定數據也證實了汽爆后芝麻粕蛋白結構的變化。高溶解度是蛋白質優良起泡性及起泡穩定性的基礎，當蛋白質溶解度較高時會增加溶液的黏度，從而使泡沫結構更硬、更穩定[23]。

在很多食品和生物體系中，蛋白質的非極性鍵與脂類的非極性脂肪族鏈存在疏水性作用。通過表6可知，相比未汽爆樣品，蒸汽爆破處理后芝麻粕蛋白持油性有所提高。通過對蛋白樣品中疏水性氨基酸測定可知，汽爆預處理后蛋白樣品發生變性，蛋白質疏水性增加，繼而形成了更多脂質與蛋白質絡合物，使得持油性升高[24]。

蛋白質的乳化特性與分子性質有關，如蛋白質的柔性、美拉德反應、疏水性等。根據紅外酰胺I波段二級結構的測定結果可知，汽爆后芝麻粕蛋白發生變性，蛋白樣品的結構慢慢展開，有序的α-螺旋結構被破壞，部分逐漸向未折疊或無序的結構轉化，蛋白樣品柔韌性增強，使其較易吸附于界面，從而增強乳化性。從色差及熒光光譜結果測定可知，汽爆后芝麻粕蛋白發生了美拉德反應，使得蛋白樣品上親水基團增多，最終形成的物質具有蛋白在油水界面上的吸附性以及糖在水相界面的溶解性質，使界面活性增強，乳化活性提高[25]。同時蒸汽爆破促使更多的蛋白質疏水基團暴露出來，繼而界面張力降低，界面吸附力升高，從而增強了油-水界膜的穩定性。

3 結論

本文研究了蒸汽爆破預處理對芝麻粕蛋白結構和功能特性的影響，旨在改善芝麻粕蛋白的功能性質。結果表明，經過蒸汽爆破處理，芝麻粕蛋白的氨基酸含量下降，疏水性增加，亮度降低，穩定性增強，ΔH的降低，蛋白樣品變得更加無序；蛋白質紅外結構表征顯示，汽爆后蛋白樣品酰胺I波段中β-折疊、β-轉角、無規則卷曲含量增加，α-螺旋減少，芝麻粕蛋白的二級結構被破壞，部分有序二級結構轉變為未折疊或無序的結構；熒光測定結果發現蒸汽爆破促進了蛋白樣品的美拉德反應；蒸汽爆破增加了芝麻粕蛋白的溶解性、水溶性，改善了發泡和乳化性能。因此，蒸汽爆破可作為一種綠色技術來改善芝麻粕蛋白的功能特性，并使改性的蛋白質有望應用于食品產業。