氯化膽堿/乳酸低共熔溶劑預(yù)處理對筍殼物化性質(zhì)及酶解效率的影響

胡強(qiáng)，王延云，蔣瓊，龔衛(wèi)華，王燕

1(樂山師范學(xué)院 竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點(diǎn)實(shí)驗室，四川 樂山，614000)2(樂山師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂山，614000)3(吉首大學(xué) 杜仲綜合利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗室，湖南 吉首，416000)

中國竹資源豐富，約有39個屬500多種竹子，竹林面積達(dá)土地總面積的5‰以上。竹筍是源于竹林的主要蔬菜食品，因其味美而長期受到國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛，竹筍產(chǎn)業(yè)已逐漸成為我國農(nóng)民致富增收的支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。但竹筍產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，隨之也帶來了數(shù)量巨大的加工副產(chǎn)物——筍殼。目前，在竹筍加工過程中，筍殼通常被作為廢棄物而直接丟棄，這不僅增加了廢棄物的處置難度，還造成了生物資源的極大浪費(fèi)[2]。筍殼是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)，由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，其中纖維素和半纖維素是由單糖組成的，通過預(yù)處理和酶解可以轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖。然而，木質(zhì)素由3種苯基丙烷結(jié)構(gòu)單元(愈創(chuàng)木酰、紫丁香基和對羥基苯基)聚合，通過共價鍵與纖維素和半纖維素交聯(lián)，組成復(fù)雜的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，形成了酶解的關(guān)鍵性屏障[3-4]。為了打破這種屏障，人們采用了許多基于不同機(jī)制的預(yù)處理方法，如：水熱、稀酸、稀堿、蒸汽爆破、有機(jī)溶劑等，但由于制備成本高、二次污染環(huán)境、有一定毒性、生物降解性差以及難以回收等缺點(diǎn)，限制了其進(jìn)一步的發(fā)展與應(yīng)用[5-9]。

近年來，低共熔溶劑(deep eutectic solvent，DES)作為預(yù)處理方法被發(fā)掘出來，它是由一定摩爾比的氫鍵受體和氫鍵供體通過氫鍵相互作用結(jié)合，熔點(diǎn)低于其原組分的共晶混合物。據(jù)報道，DES可以溶解木質(zhì)素，選擇性地降解木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物(lignin-carbohydrate complex, LCC)，是一種高效的破壞木質(zhì)纖維素生物質(zhì)屏障性的預(yù)處理方法[10-13]。更重要的是，DES對提取木質(zhì)素有較高的選擇性，這有利于再生木質(zhì)素和保留纖維素的高價值利用。并且DES還具有綠色環(huán)保、成本低、毒性小、可回收和熱穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)，從而引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[14]。氯化膽堿/乳酸溶劑已被證明是一種優(yōu)良的酸性DES體系，該體系預(yù)處理樣品后木質(zhì)素的去除率較高[5,15-16]。但預(yù)處理條件對預(yù)處理后樣品的酶解效果影響很大，ALVAREZ-VASCO等[17]使用乳酸/氯化膽堿為DES，預(yù)處理楊木與花旗松，結(jié)果表明，溫度升高，酶解效果越好，但溫度過高會抑制木質(zhì)素的分離；ZHANG等[18]用乳酸/氯化膽堿為DES，對玉米芯材進(jìn)行處理，結(jié)果表明，DES摩爾比由1∶1增至1∶15，木質(zhì)素的去除效率由33%增至61%。說明DES的溶劑摩爾比和預(yù)處理溫度會影響木質(zhì)素的脫除效果和打破木質(zhì)纖維素生物質(zhì)屏障的程度。

本研究以氯化膽堿和乳酸(摩爾比為1∶3、1∶6和1∶9)合成DES，分別在90、110和130 ℃條件下預(yù)處理筍殼木質(zhì)纖維素，脫除木質(zhì)素，并通過成分分析、掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)、X-射線衍射及結(jié)晶度指數(shù)(crystallinity index，CrI)、傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)T-IR)表征DES預(yù)處理前、后筍殼木質(zhì)纖維素的化學(xué)成分及物化特征的變化，以及對木質(zhì)纖維素酶解效率的影響，以期實(shí)現(xiàn)筍殼高效酶解轉(zhuǎn)化，為獲得高值化利用提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦竹[Pleioblastusamarus(Keng) keng]筍殼采自四川省樂山市冠英鎮(zhèn)。筍殼用蒸餾水清洗干凈，晾干，使用高速粉碎機(jī)粉碎，并篩選40～60目顆粒，隨后放入烘箱60 ℃干燥至恒重；用定性濾紙包好，置于索式抽提器內(nèi)，以V(甲苯)∶V(乙醇)=2∶1溶液為抽提劑，抽提6 h，取出放入烘箱60 ℃烘干至恒重，置于干燥器中備用。

纖維素酶Novozyme Ctec2，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；葡萄糖，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乳酸、氯化膽堿、濃硫酸、無水乙醇、DNS、乙酸、乙酸鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KYKY-FM6900LV掃描電子顯微鏡，北京中科科儀股份有限公司；D8 ADVANCE X-射線衍射儀，德國布魯克公司；Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力公司；iMark酶標(biāo)儀，深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；DHG-2050恒溫干燥箱，鄭州生元儀器有限公司；HWS電熱恒溫水浴鍋，上?；萏﹥x器制造有限公司；ST16/ST16R高速冷凍離心機(jī)，美國熱電實(shí)驗設(shè)備有限公司；GR100DP高壓滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；FP-25馬弗爐，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；FDU-2110真空冷凍干燥機(jī)，日本東京理化。

1.3 筍殼DES預(yù)處理

1.3.1 DES準(zhǔn)備

分別按摩爾比(1∶3、1∶6和1∶9)準(zhǔn)確稱取氯化膽堿與乳酸，將其混合后置于60 ℃、200 r/min的搖床上搖晃20 min進(jìn)行合成，直至體系變?yōu)闊o色透明液體，將合成的DES室溫儲存待用。

1.3.2 DES預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取5.00 g筍殼樣品于250 mL的三角瓶中，加入50 g合成的DES(摩爾比分別為1∶3、1∶6和1∶9)混合，油浴加熱處理(溫度分別為90、110和130 ℃)，處理時間為3 h，反應(yīng)過程中每隔20 min搖晃三角瓶一次。反應(yīng)結(jié)束后，立即將三角瓶置于冷水中終止反應(yīng)，然后用真空過濾法分離所得的預(yù)處理液和固相殘渣，并將固體殘渣用150 mL丙酮洗滌，后用過量去離子水洗滌，直至濾液的pH值變?yōu)橹行浴Ｗ詈髮⒐腆w殘渣置于凍干機(jī)中，-40 ℃真空干燥48 h，保存于干燥器中備用。并根據(jù)公式(1)計算樣品的固體回收率。

(1)

1.4 筍殼成分分析

筍殼中木質(zhì)纖維素的組分含量根據(jù)NY/T 3494—2019《農(nóng)業(yè)生物質(zhì)原料 纖維素、半纖維素、木質(zhì)素測定》方法測定。

1.5 表征方法

1.5.1 SEM分析

將未處理和DES處理的筍殼樣品表面分別進(jìn)行噴金處理，然后采用掃描電鏡拍攝不同放大倍數(shù)(200和2 000倍)的照片。

1.5.2 CrI分析

采用X-射線衍射儀分別對未處理和DES處理筍殼樣品進(jìn)行測試，主要條件：管壓40 kV，管流40 mA，掃描范圍5°～40°，掃描速度5 °/min，步長1°。并根據(jù)公式(2)計算樣品的結(jié)晶度指數(shù)。

(2)

式中：I002，002衍射晶面2θ=22.8°的強(qiáng)度；Iam，2θ=18°散射峰的強(qiáng)度[19]。

1.5.3 FT-IR分析

將未處理和DES處理筍殼樣品分別均勻分散于KBr中，再用壓片機(jī)壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測定，主要條件：光譜分辨率為4 cm-1，波數(shù)范圍400～4 000 cm-1，信躁比50 000∶1, 掃描64次。

1.6 筍殼酶水解

1.6.1 纖維素酶活性的測定

纖維素酶Novozyme Ctec2的酶活性采用濾紙酶活力法測試，主要步驟：將濾紙剪至1.0 cm×6.0 cm大小并卷起，放入10 mL離心管底中，加入1.0 mL的HAc-NaAc緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 4.8)和0.5 mL經(jīng)HAc-NaAc緩沖溶液稀釋后的酶液，然后將離心管置于50 ℃恒溫振蕩器中，在120 r/min下振蕩1 h，取出離心管后，置入沸水中5 min滅除酶活性。然后采用DNS法測得上清液產(chǎn)生的還原糖量，并按照公式(3)計算濾紙酶活力。

(3)

式中：m，葡萄糖含量，mg；180，分子質(zhì)量，mg/mmol；60，時間，min；0.5，加入酶的體積，mL；N，稀釋倍數(shù)。

1.6.2 酶水解測定

將未處理和DES處理筍殼樣品分別進(jìn)行酶水解，主要步驟：準(zhǔn)確稱取200 mg筍殼樣品于50 mL離心管，加入5 mL HAc-NaAc緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 4.8)和適量纖維素酶Novozyme Ctec2，置于恒溫振蕩器中(50 ℃，160 r/min)振蕩72 h，取樣，在沸水中煮沸10 min停止酶解，離心(6 000 r/min)5 min，然后采用DNS法對上清液中的還原糖進(jìn)行測定，并計算酶水解率。

1.6.3 DNS法

采用DNS法測定還原糖含量[20]，主要步驟：分別取上述上清液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入DNS試劑和蒸餾水，沸水浴中煮沸5 min，然后立即冷水冷卻。取冷卻液200 μL于酶標(biāo)板中，在540 nm酶標(biāo)儀中測定光密度值(OD)，以葡萄糖含量作為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過樣品光密度值與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算酶水解率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件數(shù)據(jù)處理，SPSS 26軟件差異性分析(P<0.05表示顯著性差異)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，試驗為3次平行；使用PowerPoint 2016版、Origin 2021軟件制圖和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 成分分析

苦竹筍殼DES預(yù)處理前后固體回收率和成分分析結(jié)果見表1。從固體回收率結(jié)果可見，DES預(yù)處理溫度從90 ℃上升到130 ℃，固體回收率從82.79%下降到69.38%，說明苦筍筍殼木質(zhì)纖維素在DES預(yù)處理過程中均有半纖維素和木質(zhì)素因溶解而被去除。從成分分析結(jié)果可見，與未處理相比，預(yù)處理后固體殘渣中纖維素的含量均有提高，從35.86%上升至48.63%；半纖維素的含量略有下降，從19.13%下降到15.59%；然而，木質(zhì)素的含量下降明顯，從28.67%下降到14.82%，這與固體回收率結(jié)果相一致?？梢?，DES預(yù)處理可高度保留苦竹筍殼木質(zhì)纖維素中的纖維素，而選擇性的溶解去除大部分的木質(zhì)素和少量的半纖維素，這與SU等[21]采用DES預(yù)處理楊樹原料的結(jié)果一致。

表1 DES預(yù)處理前后筍殼成分分析Table 1 Composition analysis of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

2.2 SEM分析

采用掃描電鏡對苦竹筍殼木質(zhì)纖維素預(yù)處理前后的表面結(jié)構(gòu)、形貌特征進(jìn)行了觀察，見圖1。從圖1-a可見，未處理的筍殼木質(zhì)纖維素表面結(jié)構(gòu)緊密、排列有序，其中纖維素相互粘結(jié)，這種天然的致密結(jié)構(gòu)是抵抗酶水解的有力屏障，可以阻止纖維素酶進(jìn)入筍殼內(nèi)部，降低酶的可及性，因此未處理苦竹筍殼的酶解效率很低，與之后未處理苦竹筍殼酶水解效率低的結(jié)果一致。從圖1-b～圖1-j可見，經(jīng)過DES預(yù)處理后，苦竹筍殼木質(zhì)纖維素完整有序的外觀結(jié)構(gòu)被破壞，被分解成纖維束，以及單獨(dú)的條狀纖維，甚至是不規(guī)則的絲線狀碎片和多孔隙的結(jié)構(gòu)，說明DES預(yù)處理會破壞纖維素與木質(zhì)素以及半纖維素的連接，不同程度地去除了木質(zhì)素及半纖維素，暴露出了纖維素。這種破壞解除了酶水解的物理結(jié)構(gòu)屏障，增加了纖維素酶的可及性，提高了酶水解效率。

比較不同預(yù)處理溫度(90、110、130 ℃)的掃描電鏡圖時發(fā)現(xiàn)，DES預(yù)處理溫度為90 ℃時，苦竹筍殼木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)部分被分離，不再緊密結(jié)合，但表面仍然存在粘結(jié)，將纖維素包裹在內(nèi)，整個筍殼木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)仍然完整有序，使纖維素酶只能有限地接觸到內(nèi)部纖維素，這也是之后酶解效率僅小幅度增加的原因；隨著預(yù)處理溫度上升至110 和130 ℃時，半纖維素和木質(zhì)素的去除程度增加，筍殼木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)變得更加疏松，纖維素大部分都被分離開，呈多間隙結(jié)構(gòu)。由此可見，預(yù)處理的溫度為110和130 ℃時比90 ℃對筍殼木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的破壞程度更為顯著。

圖1 DES預(yù)處理前后筍殼掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

2.3 CrI分析

采用X-射線衍射法研究苦竹筍殼木質(zhì)纖維素DES預(yù)處理前后的晶體結(jié)構(gòu)變化，見圖2。

圖2 DES預(yù)處理前后筍殼X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction pattern of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

未處理和預(yù)處理筍殼樣品的X-射線衍射圖峰型沒有明顯的區(qū)別，在2θ=18.0°和2θ=22.8°左右均出現(xiàn)吸收峰，分別代表無定形區(qū)Iam和結(jié)晶區(qū)I002的衍射強(qiáng)度，說明苦竹筍殼木質(zhì)纖維素在DES預(yù)處理前后均為天然Ⅰ型結(jié)晶結(jié)構(gòu)，DES預(yù)處理未改變樣品纖維素的晶型[22-23]。

研究了DES預(yù)處理反應(yīng)溫度和組分摩爾比對苦竹筍殼木質(zhì)纖維素晶體結(jié)構(gòu)的影響。由圖3可見，未處理筍殼樣品的結(jié)晶度為52.7%，經(jīng)過DES預(yù)處理筍殼樣品的結(jié)晶度為54.7%～61.5%，均有不同程度的增加。纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)對酶水解有著重要作用，高結(jié)晶度的纖維素不易被酶解，結(jié)晶度降低可以有效促進(jìn)初始酶水解[24]，這一現(xiàn)象說明，DES預(yù)處理未有效破壞筍殼樣品晶體結(jié)構(gòu)，但結(jié)晶度與半纖維素和木質(zhì)素的含量也緊密相關(guān)，脫去無定形區(qū)的半纖維素和木質(zhì)素導(dǎo)致了筍殼樣品結(jié)晶度的升高[5,25]，這與前面DES預(yù)處理前后筍殼成分分析結(jié)果一致。從反應(yīng)溫度來看，預(yù)處理溫度為90 ℃時，筍殼樣品的結(jié)晶度為54.7%～56.8%，預(yù)處理溫度升至110 和130 ℃時，結(jié)晶度略有升高，分別為57.4%～61.5%和57.2%～61.1%。從DES組分摩爾比來看，氯化膽堿與乳酸摩爾比為1∶6，預(yù)處理溫度為110 和130 ℃時，筍殼樣品的結(jié)晶度分別增至61.5%和61.1%。說明，DES預(yù)處理反應(yīng)溫度為110 和130 ℃和組分摩爾比為1∶6，苦竹筍殼樣品中的半纖維素和木質(zhì)素的去除效果最好。

圖3 DES預(yù)處理前后筍殼的結(jié)晶度指數(shù)Fig.3 Crystallinity index of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

2.4 FT-IR分析

通過傅里葉紅外光譜分析了苦竹筍殼木質(zhì)纖維素DES預(yù)處理前后各功能團(tuán)及化學(xué)鍵的變化，見圖4。與纖維素相關(guān)特征峰為898(β-1,4糖苷鍵的C—O—C拉伸)、1 373(C—H彎曲振動)與1 425 cm-1(C—H剪切振動)[18,26-27]，這些吸收峰在苦竹筍殼木質(zhì)纖維素DES預(yù)處理前后都存在，說明DES預(yù)處理未改變筍殼樣品中纖維素的結(jié)構(gòu)；在898 cm-1處吸收峰強(qiáng)度有所增加，說明筍殼樣品在DES預(yù)處理后，纖維素含量略有增長，這與成分分析結(jié)果一致。

圖4 DES預(yù)處理前后筍殼紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra pattern of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

1 737 cm-1處吸收峰對應(yīng)的是半纖維素乙酰基的伸縮振動，DES預(yù)處理后筍殼樣品此處吸收峰強(qiáng)度增加；與木質(zhì)素相關(guān)的吸收峰在833、1 250、1 511、1 604 cm-1附近，833 cm-1處對應(yīng)是丁香基木質(zhì)素中的平面振動，1 250 cm-1處對應(yīng)的是木質(zhì)素的C—O拉伸，1 511 cm-1處對應(yīng)的是芳香苯環(huán)骨架拉伸，1 604 cm-1處對應(yīng)的是芳香族苯環(huán)骨架拉伸[18,26-27]，DES預(yù)處理后，這些吸收峰強(qiáng)度均有所減弱，甚至消失。說明DES預(yù)處理后，筍殼樣品中的木質(zhì)素-半纖維素連接酯鍵結(jié)構(gòu)被打破，木質(zhì)素大部分被脫除，但結(jié)構(gòu)未被完全破壞，半纖維素仍有部分保留，這與王延云等[20]在堿聯(lián)合超高壓預(yù)處理筍殼酶解效率的研究結(jié)果一致。

2.5 酶水解

苦竹筍殼木質(zhì)纖維素DES預(yù)處理前后酶水解率是評價DES預(yù)處理效果的關(guān)鍵指標(biāo)，采用濾紙酶活力法測得纖維素酶Novozyme Ctec2的酶活性為181.39 FPU/mL，然后按200 mg筍殼樣品加入80 μL纖維素酶Novozyme Ctec2進(jìn)行酶水解，結(jié)果見圖5。未處理的苦竹筍殼中纖維素酶水解率為29.24%，DES預(yù)處理的苦竹筍殼中纖維素的酶水解率達(dá)到66.78%～90.43%，是未處理苦竹筍殼的2.3～3.1倍，說明DES預(yù)處理可以有效提高筍殼的酶水解率，這與DES預(yù)處理導(dǎo)致筍殼木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)破壞(圖1)、部分半纖維素和大量木質(zhì)素的去除(表1)有關(guān)。

圖5 DES預(yù)處理前后筍殼的酶水解率Fig.5 Enzymatic hydrolysis rate of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

研究了DES預(yù)處理反應(yīng)溫度和組分摩爾比對苦竹筍殼木質(zhì)纖維素酶水解率的影響。通常木質(zhì)素的存在對木質(zhì)纖維素的酶水解效率有抑制作用，因為木質(zhì)素粘結(jié)在纖維素表面，不僅阻礙了纖維素的酶水解，還與酶吸附形成木質(zhì)素-酶復(fù)合物，降低酶解效率[27]。隨著DES預(yù)處理溫度從90 ℃提高到130 ℃，酶水解率分別為66.78%～75.91%(90 ℃)、88.65%～90.43%(110 ℃)和69.75%～74.98%(130 ℃)，可見DES預(yù)處理在90 ℃時，筍殼樣品的纖維素酶水解率最低，說明隨著DES預(yù)處理溫度升高，筍殼木質(zhì)纖維素的物理結(jié)構(gòu)破壞加劇(圖1)，去除了更多的半纖維素和木質(zhì)素(表1)，有利于提高筍殼樣品中纖維素的酶水解率；但DES預(yù)處理在130 ℃時，筍殼樣品中纖維素酶水解率卻低于110 ℃時的酶水解率，這一現(xiàn)象說明，在DES預(yù)處理過程中過高的溫度(130 ℃)可能會導(dǎo)致纖維素和殘留木質(zhì)素發(fā)生化學(xué)修飾(?；磻?yīng))，從而降低底物的酶水解率[28-30]。另外，預(yù)處理溫度為110 ℃時，DES預(yù)處理組分(氯化膽堿和乳酸)摩爾比不同，竹筍筍殼酶水解率相當(dāng)，均達(dá)到89%以上。

3 結(jié)論

采用DES預(yù)處理苦竹筍殼，探究DES預(yù)處理對筍殼木質(zhì)纖維素組分、物化特征的變化及纖維素的酶水解效率的影響。研究表明，DES預(yù)處理破壞了苦竹筍殼木質(zhì)纖維素完整有序的外觀結(jié)構(gòu)，將其分解成纖維束，并選擇性地溶解、去除大部分的木質(zhì)素和少量的半纖維素，使纖維素保留、暴露；DES預(yù)處理未改變筍殼纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，但筍殼木質(zhì)纖維素會因脫去無定形區(qū)的部分半纖維素和大量木質(zhì)素，從而導(dǎo)致筍殼樣品結(jié)晶度的提高，這些DES預(yù)處理后筍殼木質(zhì)纖維素的性質(zhì)改變都大幅度促進(jìn)了其酶水解率的提升，筍殼木質(zhì)纖維素的酶水解率從29.24%(未處理)提升至66.78%～90.43%(DES處理)，提升了2.3～3.1倍。另外發(fā)現(xiàn)，DES預(yù)處理溫度升高，筍殼木質(zhì)纖維素的酶水解率會相應(yīng)增加，但DES預(yù)處理溫度過高(130 ℃)，反而會降低筍殼的酶水解率。本研究可為食品加工副產(chǎn)物的高值化利用(生產(chǎn)發(fā)酵糖、乙醇、乳酸等)提供指導(dǎo)。