益生菌沖劑的體外模擬消化及抗菌活性研究

莫景康，蘇可盈，黎紹基

（廣州工商學院，廣東廣州 510000）

益生菌是與人體形成共生關系并對人體健康有利的微生物，被廣泛應用于食品和醫藥領域[1-3]。常見的益生菌包括乳桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌以及球菌等[4]。益生菌在腸道內可以產生分解酶，分解腸道中游離的氨類以及吲哚等有害物質，降低有害物質對身體的侵蝕。益生菌不僅能夠促進消化吸收、增強身體免疫力、緩解過敏反應等，還具有預防癌癥以及降低膽固醇的功能，能夠產生抑制腫瘤生長的代謝產物，激活免疫系統將致癌菌、腸毒素等排出體外，減少癌癥發病率，還可以通過同化作用抑制膽固醇合成，減少人體對膽固醇的吸收，維護腸道健康[5-6]。此外，益生菌對腸道病原體也有抑制作用[7]。大腸桿菌是重要的腸道病原體，益生菌的抑菌活性是衡量益生菌產品的重要指標。

體外消化模型可用于模擬人體腸道消化的真實生理環境，通過控制實驗物質的投放，觀察和干預實驗物質的消化情況和相互作用。體外消化模型可以分為靜態模型、動態模型等[8-9]，其中靜態模型制作簡單，應用最為廣泛[10]。張林奇等[11]利用體外腸道模型對6種益生菌粉進行模擬消化的耐受性分析，發現6種益生菌粉與標識均存在差異。

益生菌的抑菌作用是其重要功能，其在腸道中的活性對其發揮益生作用至關重要。本文研究了益生菌沖劑中的益生菌對大腸桿菌的抑菌作用，并通過靜態體外消化模型研究了益生菌沖劑中的益生菌在經過胃腸道消化后的活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS固體培養基、豬膽鹽，北京奧博星生物技術有限公司；胰酶、胃蛋白酶，國藥集團化學試劑有限公司；MRS液體培養基，杭州百思生物技術有限公司；ATCC2592大腸埃希氏菌（大腸桿菌），上海保藏生物技術中心。

3種益生菌沖劑產品（A、B、C）中的益生菌信息見表1。

表1 實驗用益生菌沖劑信息

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

將有效期內的3種益生菌沖劑產品中的益生菌接種于MRS液體培養基中，于37 ℃培養活化，每24 h傳代。實驗時將細菌培養液于4 000 r·min-1離心10 min，去掉上清液，用生理鹽水懸浮，重復以上離心、懸浮、離心步驟，最后用新鮮的MRS液體培養基懸浮并稀釋至所需濃度。

1.2.2 活菌計數

活菌計數依據國家標準《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2016）[12]和張林奇等[11]所述的乳桿菌和嗜熱鏈球菌計數方法。活菌數達成率為實際活菌數占標稱活菌數的百分比。

1.2.3 大腸桿菌抑菌活性的測定

大腸桿菌抑菌活性的測定方法借鑒參考文獻[7]的方法。將大腸桿菌均勻分布于MRS固體培養基表面，取直徑為6 mm的滅菌小圓紙片，蘸取微量益生菌培養液（3種產品益生菌接種濃度統一為2.5×107CFU·mL-1）置于培養基表面，密封膜密封后倒置放入37 ℃培養箱培養72 h。用游標卡尺測量抑菌圈直徑，對比3種產品中益生菌的抑菌能力。

1.2.4 體外模擬胃腸道消化

（1）人工胃液和腸液的配制。配制方法參照文獻[13]，具體有以下幾方面。①人工胃液的配制。取稀鹽酸（6 mol·L-1）16.4 mL，加入800 mL去離子水攪拌混合。調pH值至2.5，將其倒入1 000 mL容量瓶，加入去離子水定容。高壓滅菌后冷卻至室溫，加入10 g胃蛋白酶，攪拌至完全溶解。②人工腸液的配制。稱取6.8 g磷酸二氫鉀，加入500 mL去離子水攪拌至溶解。用氫氧化鈉（0.1 mol·L-1）調節pH值至6.8，繼續加入去離子水定容至1 L，高壓滅菌后冷卻至室溫，加入豬膽鹽3 g，胰蛋白酶10 g，充分攪拌至完全溶解。

（2）3種益生菌沖劑活性的測定。通過體外模擬胃腸道消化測定3種益生菌沖劑的活性。將1 mL濃度為7.5×107CFU·mL-1的菌液加至20 mL人工胃液中，密封，并于37 ℃中以90 r·min-1恒溫搖蕩培養1 h，然后加入80 mL人工腸液，密封后再放入37 ℃振蕩機中，120 r·min-1繼續搖蕩培養2 h。以接種菌液的MRS液體培養基為陽性對照，以無接種菌液的人工胃、腸液為陰性對照。培養后取1 mL菌懸液用PBS緩沖液（pH 7.2）進行梯度稀釋，平板培養后進行活菌計數，并按公式（1）計算存活率。

式中：Ni為ih后的活菌數；N0為初始活菌數。

2 結果與分析

2.1 活菌數情況

如表2所示，3種益生菌沖劑的活菌數存在較大差異，3種產品活菌數均超過1×106CFU·g-1，但均未達到產品標稱活菌數。其中A產品的活菌數達成率最高。

表2 3種益生菌沖劑菌落生長情況

2.2 抑菌活性

如表3所示，3種產品中的益生菌都表現出了對大腸桿菌的抑制能力，且抑菌能力的排序為C＞A＞B。說明3種益生菌產品都能在大腸桿菌大量存活的大腸環境中存活，且具有一定的抑菌活性。

表3 3種益生菌產品對大腸桿菌抑菌能力

2.3 模擬消化

3種益生菌沖劑產品經模擬消化后，僅有A產品具有存活能力（0.000 04%）；B、C產品并沒有生長繁殖。表明在經過體外模擬消化后，大多數益生菌被胃腸液消化導致失活，僅有極少數能成功生長并繁殖，詳見表4。

表4 3種益生菌產品體外模擬消化后的活性

3 結論

本研究利用大腸桿菌測試3種產品益生菌的抑菌能力，可發現3種產品益生菌都有表現出對大腸桿菌的抑菌能力。經模擬胃腸道消化后，3種益生菌產品僅有A產品的益生菌有少量存活。如何提高產品益生菌的耐消化活性是各個廠家研發人員需要重點解決的問題。本研究對益生菌沖劑產品的探究，能為市場監管部門提供數據支撐，也能幫助企業開發出更好的同類產品。