植物甾醇納米粒降低高膽固醇HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇的作用效果研究

焦文佳，石劍夫，黃志芬，陳穎怡，祝愛俠，王春維,5

（1．廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東廣州 511442；2．廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442；3．廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，廣東廣州 511442；4.武漢輕工大學(xué) 動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢 430023；5.國家糧食局糧油資源綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430023）

植物甾醇是一類以環(huán)戊烷全氫菲為骨架的醇類化合物，是構(gòu)成植物細(xì)胞膜的活性成分之一，其中β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇等是最常見的天然植物甾醇[1]。此外，植物甾醇與膽固醇兩者結(jié)構(gòu)類似，主要骨架均為環(huán)戊烷全氧菲（甾核），是四環(huán)三萜類化合物，屬于無甲基甾醇，手性結(jié)構(gòu)相同。近年來，植物甾醇成為食品熱門營養(yǎng)元素之一，被科學(xué)家們譽為“生命的鑰匙”，具有許多十分重要的生理功效，如降低膽固醇、抗炎、抗氧化和抗癌等作用[2]。當(dāng)人體攝入過多的膽固醇時，肝臟等器官自動調(diào)節(jié)膽固醇的吸收和排泄的功能會發(fā)生障礙，多余的膽固醇不能正常排出體外，會導(dǎo)致血清中膽固醇升高，造成高膽固醇血癥或高血脂癥[2]。人體攝入植物甾醇后，由于其結(jié)構(gòu)與膽固醇十分相似，會在腸道內(nèi)與膽固醇競爭乳糜微粒表面的吸附位點從而降低膽固醇的吸收[3]；當(dāng)二者共存于腸腔內(nèi)時，可共同結(jié)晶沉淀，形成不溶物排出體外，進而達到降低膽固醇的作用[4-5]；同時，植物甾醇還能通過影響相關(guān)酶的活性，抑制膽固醇在肝臟內(nèi)的生物合成及代謝[6]。

植物甾醇具有降低膽固醇的作用，能夠降低人群高膽固醇血癥的發(fā)生概率，但存在高熔點、低溶解度和低生物利用度等一系列問題，進而嚴(yán)重影響其食品品質(zhì)、應(yīng)用價值和范圍[7]。在食品工業(yè)中，主要是對植物甾醇進行物理、化學(xué)改性處理，以此來改善其溶解性或分散性，更好地利用其生理功效。物理改性形成的體系主要有納米粒、微/納米乳液、微/納米膠囊、脂質(zhì)體等。周士嬌等[8]采用超聲輔助反溶劑沉淀法制備出粒徑為252.77～215.90 nm、包封率為95.39%～81.55%的乳清分離蛋白-植物甾醇納米顆粒，所得納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性，有利于小腸對植物甾醇的吸收，發(fā)揮其抑制膽固醇吸收的作用。駱兆嬌等[9]采用高壓微射流技術(shù)制備出豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒（OP-PS），所得OP-PS納米顆粒粒徑為139.28 nm，包埋率達98.63%，且具有較好的穩(wěn)定性和水分散性。在前期研究中，本課題組運用現(xiàn)代納米技術(shù)制備出一種粒徑小[（93.35±1.222）nm]、分布均勻、穩(wěn)定性良好的植物甾醇納米粒[10]。

目前，關(guān)于植物甾醇降低膽固醇效果的研究較多，但植物甾醇納米粒的制備改變了植物甾醇的溶解性、穩(wěn)定性及吸收效率等，其降膽固醇效果需進行進一步探究。細(xì)胞水平試驗可在一定程度上消除器官試驗中細(xì)胞間的復(fù)雜作用，或體內(nèi)試驗中神經(jīng)體液調(diào)節(jié)的干擾，考察藥物直接作用于細(xì)胞的結(jié)果[11-12]。人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞雖為一種癌細(xì)胞，但其生物學(xué)特征與正常肝細(xì)胞相近[13]，并含有與人正常肝細(xì)胞具有同源性的生物轉(zhuǎn)化代謝酶，其具有較高的分化程度，保留性較完整且具有穩(wěn)定的活性，便于進行傳代培養(yǎng)，是國際公認(rèn)的研究降脂作用的細(xì)胞系[14-15]，廣泛用于模擬人體正常肝臟細(xì)胞，且常用于毒理學(xué)和肝臟保護等研究[16-17]。為更好地了解前期所制備的植物甾醇納米粒的降膽固醇效果，本研究以人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞為輔助研究對象，觀察不同劑量植物甾醇納米粒對高膽固醇誘導(dǎo)的HepG2模型細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響，從體外試驗研究明確植物甾醇納米粒的降膽固醇效果，為植物甾醇納米粒的應(yīng)用提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物甾醇（≥95%），武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司；大豆卵磷脂（≥70%），阿拉丁試劑有限公司；大豆分離蛋白（≥95%），新西蘭恒天然有限公司；HepG2細(xì)胞，上海中科院細(xì)胞庫；辛伐他汀（細(xì)胞級），MedChemExpress（MCE）公司；膽固醇，美國Sigma公司；96孔培養(yǎng)板、凍存管，Corning公司；70 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，JETBIOFIL公司。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、PBS緩沖液，Gibco公司；0.25%胰蛋白酶溶液，杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；雙抗（PS，青霉素、鏈霉素），Hyclone公司；二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma公司；MTS，普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；組織總膽固醇酶法測定試劑盒（E1015），北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、RIPA裂解液（強）、PMSF（100 mmol·L-1），碧云天生物技術(shù)研究所；總膽汁酸（Total Bile Acid，TBA）測試盒、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）測試盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

INC108 CO2培 養(yǎng) 箱，德 國Memment公 司；TDZ5-WS 離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；XD-30倒置顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；iMark酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同濃度植物甾醇納米粒（PNP）的制備

按照前期研究[10]所得植物甾醇納米粒的最佳制備工藝條件制備植物甾醇納米粒，主要制備工藝如下。制備濃度為0.75%（w/w）大豆分離蛋白（SPI）分散液，4 ℃水化過夜；將植物甾醇與卵磷脂按1∶4（w/w）比例溶解在16 mL無水乙醇中，形成有機相；對SPI分散液進行高速分散（轉(zhuǎn)速為10 000 r·min-1），并將有機相緩慢注入其中，之后繼續(xù)分散5 min；所得混合溶液通過高壓均質(zhì)（均質(zhì)壓力為900 bar，均質(zhì)次數(shù)為6次）形成穩(wěn)定的植物甾醇納米分散液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，加水稀釋，得到試驗所需不同濃度的植物甾醇納米粒（PNP）。

1.3.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞于完全培養(yǎng)液（含10%FBS+1%PS+89%高糖DMEM培養(yǎng)基）中恒溫靜置培養(yǎng)，每隔2～3 d更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)期間應(yīng)注意用顯微鏡觀察細(xì)胞有無被污染及細(xì)胞的生長情況，待細(xì)胞生長密度達到70%～80%時，即可進行細(xì)胞傳代。進行2～3次傳代至細(xì)胞生長情況穩(wěn)定后進行下一步細(xì)胞試驗。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)的具體操作參考文獻[18]中的方法。

1.3.3 植物甾醇納米粒和辛伐他汀對HepG2細(xì)胞活力的影響測定

為確定后續(xù)試驗中植物甾醇納米粒和辛伐他汀的作用濃度，本試驗采用MTS方法測定植物甾醇納米粒和辛伐他汀對HepG2細(xì)胞活力的影響。

試驗分為空白組、空白對照組、植物甾醇納米粒組（PNP，6個濃度）和陽性藥物辛伐他汀組（Sim，5個濃度），每組設(shè)6個復(fù)孔。PNP的干預(yù)終濃度分別是50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1、600 μg·mL-1和800 μg·mL-1；Sim干預(yù)終濃度為10 μmoL·mL-1、20 μmoL·mL-1、30 μmoL·mL-1、40 μmoL·mL-1和50 μmoL·mL-1；空白組為培養(yǎng)基；空白對照組為細(xì)胞+培養(yǎng)基。

按照MTS試劑盒說明書的要求檢測在植物甾醇納米粒和辛伐他汀中分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后HepG2細(xì)胞活力。按下列公式計算細(xì)胞活力，由此得出植物甾醇納米粒及辛伐他汀作用濃度及作用時間范圍。

1.3.4 高膽固醇HepG2細(xì)胞模型的建立

按照1.3.2的方法對細(xì)胞進行常規(guī)培養(yǎng)，將對數(shù)生長期的細(xì)胞消化、懸浮，細(xì)胞懸液均勻鋪在6孔板中。試驗分組如下。①正常組。常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞。②模型組。含0.20 mmol·L-1膽固醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。③陽性藥物Sim組。含0.20 mmol·L-1膽固醇、20 μmoL·mL-1Sim的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。④PNP組。含0.20 mmol·L-1膽固醇、不同濃度的PNP（50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1）的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞；每個處理6個重復(fù)。作用24 h后，收集每孔中的培養(yǎng)基和細(xì)胞，按照相應(yīng)試劑盒的要求處理。

1.3.5 培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量的測定

試驗結(jié)束后，收集培養(yǎng)基和細(xì)胞，按試劑盒說明書要求加入適量的細(xì)胞裂解液進行細(xì)胞裂解，并于室溫2 000×g離心細(xì)胞和培養(yǎng)基，于550 nm波長下測定各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)總膽固醇的濃度。

1.3.6 培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量測定

按照蛋白濃度測定試劑盒（BCA法）說明書要求，分別將1.3.5中余下的細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)基于室溫以（10 000～14 000）×g離心3～5 min，取上清液用于測定。于562 nm波長下測定各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用樣品的體積分別計算出培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量。

1.3.7 培養(yǎng)基中總膽汁酸（TBA）含量的測定

將收集到的細(xì)胞培養(yǎng)基進行離心，按照試劑盒說明加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本、試劑一和試劑二，混勻，37 ℃孵育1.5 min后，于405 nm波長下測定各孔OD值，計算培養(yǎng)基中TBA的含量為

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)測定

嚴(yán)格按照超氧化歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）試劑盒說明測定上述細(xì)胞裂解液中這兩種抗氧化指標(biāo)的活力，并用樣本中所含的蛋白濃度來進行校正，相關(guān)計算公式為

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（x—±SEM）表示，兩組間比較用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行t檢測，多組間比較采用one-way ANOVA檢測，以P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物甾醇納米粒對HepG2細(xì)胞活力的影響

HepG2細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的植物甾醇納米粒分別干預(yù)6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后，其細(xì)胞活力大小如圖1所示。與空白對照組相比，不同濃度植物甾醇納米粒分別作用HepG2細(xì)胞不同時間后，對HepG2細(xì)胞活力均有極顯著的影響（P＜0.001）。在6 h和12 h內(nèi)，經(jīng)所有濃度的植物甾醇納米粒作用后的HepG2細(xì)胞活力仍均在90%以上；在24 h和48 h內(nèi)，800 μg·mL-1植物甾醇納米粒作用下的HepG2細(xì)胞活力分別為88.8%和87.3%，其他濃度植物甾醇納米粒處理下的HepG2細(xì)胞活力均在90%以上；在72 h內(nèi)，600 μg·mL-1和800 μg·mL-1植物甾醇納米粒干預(yù)下的HepG2細(xì)胞活力分別為89.1%和87.2%，其他濃度植物甾醇納米粒干預(yù)的HepG2細(xì)胞活力均在90%以上。同一濃度的植物甾醇納米粒培養(yǎng)細(xì)胞不同時間后，隨著培養(yǎng)時間的延長，HepG2細(xì)胞活力越來越低（P＜0.001）；相同時間內(nèi)，隨著植物甾醇納米粒濃度的增大，HepG2細(xì)胞活力極顯著降低（P＜0.001），說明植物甾醇納米粒對HepG2細(xì)胞活力的影響呈現(xiàn)劑量和時間效應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞活力低于80%時即認(rèn)為該藥物具有細(xì)胞毒性[19]。從試驗結(jié)果來看，在試驗濃度和作用時間范圍內(nèi)，植物甾醇納米粒不具有細(xì)胞毒性，所以可以根據(jù)試驗需要選擇所需濃度和時間，但由于植物甾醇納米粒為淡黃色，考慮到顏色對吸光度的影響，故選擇濃度分別為50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1的植物甾醇納米粒進行后續(xù)試驗。

圖1 植物甾醇納米粒對HepG2細(xì)胞活力的影響

2.2 辛伐他汀對HepG2細(xì)胞活力的影響

因試驗需選用辛伐他汀（Sim）作為陽性對照，故考察了不同濃度的辛伐他汀對HepG2細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖2所示。不同濃度的辛伐他汀干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時間后，細(xì)胞活力較空白對照組均極顯著降低（P＜0.001）。相同時間內(nèi)，HepG2細(xì)胞活力隨著辛伐他汀濃度的增大而極顯著降低（P＜0.001），相同濃度的辛伐他汀干預(yù)細(xì)胞不同時間后，HepG2細(xì)胞活力隨著干預(yù)時間的延長而極顯著降低（P＜0.001），說明辛伐他汀對HepG2細(xì)胞活力的影響呈現(xiàn)明顯的劑量和時間效應(yīng)。在6 h、12 h和24 h內(nèi)，50 μmoL·mL-1Sim干預(yù)下的HepG2細(xì)胞活力分別為85.0%、81.1%和80.2%，其他濃度Sim干預(yù)下的HepG2細(xì)胞活力大于90%；在48 h內(nèi)，40 μmoL·mL 和50 μmoL·mL-1Sim作用下的HepG2細(xì)胞活力分別為89.4%和77.8%，其余濃度的Sim處理下的HepG2細(xì)胞活力均在90%以上；在72 h內(nèi)，5個濃度Sim干預(yù)下的HepG2細(xì)胞活力分別為93.2%、89.9%、89.0%、87.0%和75.9%。從試驗數(shù)據(jù)可看出，50 μmoL·mL-1Sim在作用HepG2細(xì)胞超過24 h后呈現(xiàn)出細(xì)胞毒性，其他濃度的Sim在相應(yīng)的作用時間內(nèi)不具有細(xì)胞毒性。綜合試驗結(jié)果考慮，選用20 μmoL·mL-1Sim進行后續(xù)研究。

圖2 辛伐他汀對HepG2細(xì)胞活力的影響

2.3 植物甾醇納米粒對HepG2培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量的影響

不同濃度的植物甾醇納米粒對培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量的影響如圖3所示。模型組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量極顯著高于正常組（P＜0.01），經(jīng)不同濃度的植物甾醇納米粒處理后，各處理組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量均極顯著低于模型組（P＜0.01）。其中 濃 度 為50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1植物甾醇納米粒組的細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量較模型組分別降低了16.97%、23.80%、30.36%和39.71%（P＜0.01），但均極顯著高于正常組（P＜0.01），不同濃度植物甾醇納米粒組組間差異極顯著（P＜0.01）。說明植物甾醇納米粒能有效降低高膽固醇細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量，同時具有極顯著的劑量效應(yīng)，但在試驗濃度范圍內(nèi)，其效果極顯著低于陽性藥物辛伐他汀（P＜0.01）。對于培養(yǎng)基中膽固醇濃度，各組組間差異均極其顯著（P＜0.01），且培養(yǎng)基中的總膽固醇含量隨植物甾醇納米粒濃度的增大而極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，濃度為50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1植物甾醇納米粒組的培養(yǎng)基中總膽固醇含量分別升高了53.56%、73.64%、104.43%和125.69%（P＜0.01）。

圖3 不同濃度的植物甾醇納米粒對培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量的影響

2.4 植物甾醇納米粒對培養(yǎng)基中總膽汁酸含量的影響

不同濃度的植物甾醇納米粒對培養(yǎng)基中總膽汁酸含量的預(yù)防效果如圖4所示。模型組和各給藥組培養(yǎng)基中總膽汁酸含量均低于正常組，但不存在顯著差異（P＞0.05），且各組組間差異均不顯著（P＞0.05），說明植物甾醇納米粒對培養(yǎng)基中總膽汁酸含量沒有顯著的預(yù)防效果。

圖4 不同濃度的植物甾醇納米粒對培養(yǎng)基中總膽汁酸含量的影響

2.5 植物甾醇納米粒對HepG2細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響

不同濃度的植物甾醇納米粒對細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活力的影響如圖5和6所示。模型組細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活力分別降低了66.84%和58.67%，均極顯著地低于正常組（P＜0.01）；經(jīng)過不同濃度的植物甾醇納米粒干預(yù)24 h后，細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活力較模型組均極顯著提高（P＜0.01），且隨著植物甾醇納米粒濃度的增大，其活力提高越明顯；與模型組相比，4個濃度的植物甾醇納米粒（50 μg·mL-1，100 μg·mL-1，200 μg·mL-1和400 μg·mL-1）干預(yù)下細(xì)胞SOD活力分別升高了25.11%、50.06%、87.53%和112.89%，分 別 比 正 常 組 低58.52%、50.24%、37.82%和29.41%；細(xì)胞CAT活力分別升高了20.66%、35.80%、62.87%和75.71%，分別較正常組低50.14%、43.88%、32.69%和27.39%，且各組之間均存在極顯著的差異（P＜0.01）。說明植物甾醇納米粒能夠有效提高高膽固醇細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT的活力，且具有極顯著的劑量效應(yīng)，但效果低于比陽性藥物辛伐他汀，在試驗濃度范圍內(nèi)不能使SOD和CAT活力恢復(fù)至正常水平。

圖5 不同濃度的植物甾醇納米粒對細(xì)胞內(nèi)SOD活力的影響

圖6 不同濃度的植物甾醇納米粒對細(xì)胞內(nèi)CAT活力的影響

3 結(jié)論

本研究以人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞為輔助研究對象，并用膽固醇誘導(dǎo)，構(gòu)建高膽固醇細(xì)胞模型，再用不同濃度的植物甾醇納米粒進行干預(yù)，觀察不同劑量植物甾醇納米粒對高膽固醇誘導(dǎo)的HepG2模型細(xì)胞的降膽固醇效果。植物甾醇納米粒不具有細(xì)胞毒性，能顯著降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，且存在極顯著（P＜0.01）的劑量效應(yīng)；能夠顯著提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)SOD和CAT的活力，劑量效應(yīng)顯著（P＜0.01）。本研究為植物甾醇納米粒的降膽固醇效果提供理論依據(jù)，為植物甾醇納米粒作為膳食補充劑的應(yīng)用提供了技術(shù)支持。