裂殖壺菌的雙碳源發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸控制策略

趙祥穎，張華秋，張家祥,,3，劉麗萍，韓墨，趙晨，姚明靜，劉建軍

1(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南，250013)2(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南，250013)3(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南，250013)

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid， DHA)是一種食用安全的ω-3型多不飽和脂肪酸[1]，俗稱腦黃金，在促進(jìn)人體視覺器官、大腦發(fā)育以及治療心臟疾病、炎癥、癌癥、焦慮癥[2-3]等方面具有獨(dú)特的生理功能，尤其對(duì)處于生長(zhǎng)發(fā)育階段的嬰幼兒健康至關(guān)重要[4]。人體無(wú)法自行合成DHA，只能通過(guò)外部攝取。目前，DHA產(chǎn)品主要來(lái)源于深海魚油，但產(chǎn)品質(zhì)量會(huì)隨魚種類、捕撈季節(jié)、地點(diǎn)的差異而不同，且易受環(huán)境污染。研究表明魚類體內(nèi)的DHA是通過(guò)食物鏈蓄積獲得，主要來(lái)源于海洋微生物[5]。能夠合成DHA的海洋微生物主要是一些低等海洋真菌和微藻，如破囊壺菌(Thraustochytrium)、裂殖壺菌(Aurantiochytrium)和隱甲藻(Crypthecodinium)等[6]。微生物發(fā)酵法制備DHA，具有生長(zhǎng)周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng)[7]、不飽和脂肪酸成分單一、分離純化簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，有望替代魚油成為DHA主要來(lái)源。

裂殖壺菌是一種異養(yǎng)型海洋真菌，其脂肪酸組成簡(jiǎn)單，DHA含量較高，是具有商業(yè)開發(fā)潛力的DHA主要生產(chǎn)菌株。裂殖壺菌可利用多種碳源生產(chǎn)DHA，葡萄糖因價(jià)格低廉，常被用作裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的底物。在一些研究中裂殖壺菌利用甘油可以獲得更高的DHA產(chǎn)量[8-10]；也有研究表明，使用甘油和葡萄糖的混合碳源可以促進(jìn)DHA的積累[11-12]，但甘油和葡萄糖2種碳源的混合策略比較復(fù)雜。在前期工作中，作者研究了1株裂殖壺菌突變株SFD-1502利用甘油和葡萄糖生產(chǎn)DHA的發(fā)酵行為，發(fā)現(xiàn)葡萄糖作為碳源有利于底物消耗；甘油作為碳源有利于DHA的積累。為了將兩種碳源優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，縮短發(fā)酵時(shí)間，提高DHA產(chǎn)量，進(jìn)一步提高SFD-1502發(fā)酵生產(chǎn)DHA的效率，本文詳細(xì)探討了葡萄糖和甘油2種碳源單獨(dú)或混合培養(yǎng)對(duì)菌株SFD-1502的DHA油脂合成的影響，并構(gòu)建一種新型的雙碳源發(fā)酵控制策略，即前期使用葡萄糖培養(yǎng)以利于菌體生長(zhǎng)，中后期發(fā)酵液中的葡萄糖濃度為10～5 g/L時(shí)補(bǔ)加甘油以利于提高油脂中的DHA比例并減少菌體生長(zhǎng)延滯期，實(shí)現(xiàn)了DHA的高效生產(chǎn)且具有較高的工業(yè)推廣價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

裂殖壺菌(Aurantiochytriumlimacinum)SFD-1502，實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

人工海水(g/L)：NaCl 11.2，KCl 0.8，MgSO41.9，CaSO40.9，MgCl22.6。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉20，谷氨酸鈉5，用50%(體積分?jǐn)?shù))人工海水配制。

葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖132，酵母粉5.75，玉米漿14.6，谷氨酸鈉6.66，(NH4)2SO41，用50%(體積分?jǐn)?shù))人工海水配制。

甘油發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油120，酵母粉5.75，玉米漿14.6，谷氨酸鈉6.66，(NH4)2SO41，用50%(體積分?jǐn)?shù))人工海水配制。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖，山東西王糖業(yè)有限公司；酵母粉，安琪酵母股份有限公司；十九烷酸標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich公司；消泡劑，山師化工廠；其他試劑來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.4 儀器與設(shè)備

Alphaclean1300潔凈工作臺(tái)，力康精密儀器(上海)有限公司；恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；U3000液相色譜儀，戴安中國(guó)有限公司；7890B氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；7200分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限公司；LGJ-10E冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；5 L標(biāo)準(zhǔn)全自動(dòng)發(fā)酵罐，匯森生物設(shè)備鎮(zhèn)江有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：將保存有菌株SFD-1502的甘油管接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h，按5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種量再次轉(zhuǎn)接到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)17 h，用于接種搖瓶發(fā)酵。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的液體種子，按5%接種量接種到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：接種量7%，28 ℃，通氣量0.5 m3/h，罐壓0.1 MPa，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制0～12 h相對(duì)溶氧濃度為10%～20%，12 h以后相對(duì)溶氧濃度為0.5%～5%。

1.2.2 菌體濃度測(cè)定

發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后在600 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.3 細(xì)胞干重的測(cè)定

量取45 mL的發(fā)酵液于50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)NaCl溶液離心洗滌2次，凍干稱重。

1.2.4 油脂含量的測(cè)定

稱取1 g干菌粉置于10 mL離心管中，用5 mL正己烷浸泡，并間接超聲波處理5 min，于3 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液于干凈試管備用，重復(fù)抽提3次，將3次所得上清液合并后置于60 ℃烘箱，蒸干溶劑，待恒重后測(cè)定油脂含量(質(zhì)量百分比)。

1.2.5 葡萄糖、甘油含量的測(cè)定

將發(fā)酵液離心(8 000 r/min，5 min)，后取上清液稀釋至50～200倍使用配備葡萄糖氧化酶電極的生物傳感分析儀測(cè)定殘余葡萄糖。

發(fā)酵液離心后取上清液，稀釋至合適濃度，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行HPLC分析。HPLC條件：高效液相色譜儀，配備示差折光檢測(cè)器；色譜柱HPX-87H(Bio Rad, USA)；流動(dòng)相0.005 mol/L H2SO4，三級(jí)水配制；流速0.6 mL/min；柱溫65 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.6 DHA含量的測(cè)定[13]

取發(fā)酵液5～10 mL，離心收集菌體，用1% NaCl溶液離心洗滌2次，棄去上清液，加入4 mL 4 mol/L鹽酸溶液，混勻后沸水浴10 min，冷卻至室溫后冰浴10 min，加入正己烷10 mL，充分振蕩1 min，靜置分層后，取上層清液1 mL，加入1 mL十九烷酸內(nèi)標(biāo)液(稱取十九烷酸標(biāo)準(zhǔn)品 0.04 g，于 10 mL容量瓶中，加入適量正己烷溶解，然后稀釋至刻度，搖勻備用)，和0.2 mL 4 mol/L KOH-甲醇溶液，劇烈振蕩1 min，離心分層，取上層有機(jī)相用于氣相色譜分析。

采用安捷倫7890B氣相色譜儀，DB-23(60 mm×0.25 mm×0.25 mm)毛細(xì)管柱用于油脂的氣相色譜分析。選用高純N2作為載氣，柱流量3.0 mL/min，尾吹流量30 mL/min，氣化室溫度250 ℃；檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器，溫度280 ℃，H2流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min；柱箱初始溫度100 ℃，之后以25 ℃/min升至200 ℃，再以4 ℃/min升至230 ℃，保持9 min；進(jìn)樣量為1 μL，分流比為30∶1。

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量,脂肪酸含量按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：Ai,脂肪酸甲酯峰面積；As,內(nèi)標(biāo)峰面積；fis,脂肪酸甲酯i相對(duì)于內(nèi)標(biāo)的相對(duì)校正因子；Mi,脂肪酸i的相對(duì)分子質(zhì)量；Mm,脂肪酸i甲酯的相對(duì)分子質(zhì)量；m,待測(cè)試樣質(zhì)量；ms,內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖和甘油單一碳源培養(yǎng)菌株SFD-1502

分別以120 g/L葡萄糖和120 g/L甘油為碳源，采用搖瓶發(fā)酵進(jìn)行菌株SFD-1502培養(yǎng)，不同培養(yǎng)時(shí)間取樣測(cè)定碳源消耗、細(xì)胞干重、細(xì)胞油脂含量以及油脂中DHA所占比例，繪制菌株SFD-1502的發(fā)酵進(jìn)程曲線，如圖1所示。

a-底物質(zhì)量濃度；b-細(xì)胞干重；c-油脂含量；d-油脂中DHA含量圖1 兩種碳源單獨(dú)發(fā)酵生產(chǎn)DHA進(jìn)程Fig.1 Fermentation process of SFD-1502 by glucose and glycerol

單一碳源發(fā)酵結(jié)果顯示，以葡萄糖為碳源菌株SFD-1502底物消耗速度更快，培養(yǎng)84 h葡萄糖被全部消耗；以甘油為碳源培養(yǎng)菌株SFD-1502底物消耗速度慢，培養(yǎng)84 h甘油仍有約1/3殘留，培養(yǎng)至120 h，仍殘留4.76 g/L。以葡萄糖為碳源細(xì)胞生長(zhǎng)速度也快，96 h達(dá)到最大值47 g/L，以甘油為碳源時(shí)108 h才達(dá)到最大值47.75 g/L，但2種碳源最終菌體干重差距并不顯著。以葡萄糖、甘油單一碳源培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞中油脂含量都是持續(xù)增加的，以葡萄糖為碳源油脂含量增長(zhǎng)較快，以甘油作為碳源油脂積累滯后于葡萄糖，但總產(chǎn)量與葡萄糖相當(dāng)。最令人關(guān)注的是以甘油為碳源油脂中的DHA含量顯著高于葡萄糖，油脂中DHA比例最高達(dá)47.49%，而以葡萄糖為碳源最高只有37.46%。

2.2 雙碳源混合發(fā)酵

通過(guò)上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源有利于菌體生長(zhǎng)，發(fā)酵周期短，但油脂中DHA含量低，而以甘油為碳源油脂中DHA的含量高，但發(fā)酵周期長(zhǎng)。為充分發(fā)揮2種碳源各自優(yōu)勢(shì)，考察2種碳源預(yù)混合培養(yǎng)對(duì)菌株SFD-1502發(fā)酵產(chǎn)DHA的影響。將2種碳源按照不同的比例混合配制培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72 h取樣分析，結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)72 h取樣是為了獲得2種底物的消耗情況，避免因培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)底物被完全消耗造成的誤差。

采用葡萄糖、甘油雙碳源混合發(fā)酵，總碳源消耗量比葡萄糖單一碳源發(fā)酵顯著降低，甚至比甘油單一碳源還要低，同時(shí)菌體生長(zhǎng)也受到一定程度的抑制。以葡萄糖單碳源發(fā)酵72 h葡萄糖消耗為93.7 g/L，菌體干重達(dá)到39.92 g/L，而雙碳源混合發(fā)酵總碳源消耗大約只有單獨(dú)使用葡萄糖的1/2。同時(shí)，采用雙碳源混合發(fā)酵時(shí)甘油被優(yōu)先利用，葡萄糖的利用速率明顯降低。與甘油單一碳源發(fā)酵相比，葡萄糖同樣也影響了甘油的消耗速率(P<0.05)。在油脂合成方面，雙碳源發(fā)酵細(xì)胞中油脂含量明顯低于葡萄糖單一碳源，但油脂中的DHA比例似乎未受到影響，并隨著混合碳源中甘油比例的增加而增加。上述結(jié)果表明，使用葡萄糖和甘油的雙碳源混合發(fā)酵，會(huì)嚴(yán)重影響裂殖壺菌細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂合成。

a-碳源消耗量；b-細(xì)胞干重；c-油脂含量；d-DHA含量圖2 菌株SFD-1502葡萄糖+甘油混合碳源發(fā)酵結(jié)果Fig.2 Fermentation results of SFD-1502 using Glu and Gly mixed carbon source注:Glu-葡萄糖；Gly-甘油;同一圖中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)

2.3 雙碳源分段控制發(fā)酵

2.3.1 雙碳源分段發(fā)酵甘油添加時(shí)機(jī)

葡萄糖有利于菌株生產(chǎn)，甘油有利于DHA的積累，但將葡萄糖和甘油簡(jiǎn)單混合培養(yǎng)則嚴(yán)重阻礙了菌體生長(zhǎng)和油脂合成。為了更好地發(fā)揮2種碳源的優(yōu)勢(shì)，嘗試采用雙碳源分段發(fā)酵策略：前期以葡萄糖為碳源促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，然后補(bǔ)加甘油促進(jìn)DHA的合成。為了掌握甘油添加時(shí)機(jī)，首先考察了不同的初始葡萄糖濃度消耗進(jìn)程(圖3)，20 g/L初始葡萄糖質(zhì)量濃度大約需要24 h消耗完，40 g/L葡萄糖約需32 h，60 g/L葡萄糖約需44 h。

分別采用20、40、60 g/L質(zhì)量濃度的葡萄糖進(jìn)行前期菌體培養(yǎng)，當(dāng)葡萄糖耗盡時(shí)分別補(bǔ)加甘油，使總碳源質(zhì)量濃度均為120 g/L，發(fā)酵結(jié)果如表1所示。同樣培養(yǎng)120 h，葡萄糖耗盡時(shí)補(bǔ)加甘油的發(fā)酵液中甘油殘留量比甘油單一碳源時(shí)還要高，甘油添加量越多殘留量越高，這說(shuō)明葡萄糖促菌體生長(zhǎng)非但沒(méi)有加速甘油消耗，反而減緩了其消耗。

實(shí)驗(yàn)又采用40 g/L的初始葡萄糖濃度對(duì)甘油添加時(shí)機(jī)進(jìn)行了進(jìn)一步考察。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度分別降至20、10、5、0 g/L時(shí)，補(bǔ)加80 g/L的甘油，發(fā)酵結(jié)果如圖4所示。當(dāng)剩余葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)補(bǔ)加甘油發(fā)酵結(jié)果和混合碳源相似，葡萄糖的存在抑制了甘油的消耗，延緩了整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程。當(dāng)剩余葡萄糖質(zhì)量濃度為10、5 g/L時(shí)補(bǔ)料，獲得了比較理想的效果：甘油消耗速有所提升，發(fā)酵120 h所有碳源均消耗完全，油脂中的DHA比例與甘油單一碳源結(jié)果接近，最高值達(dá)47.19%，因此，采用雙碳源發(fā)酵策略時(shí)，甘油的添加時(shí)機(jī)對(duì)發(fā)酵結(jié)果至關(guān)重要。

a-葡萄糖消耗；b-OD600圖3 SFD-1502利用不同濃度葡萄糖的發(fā)酵進(jìn)程Fig.3 Consumption process of SFD-1502 using different concentrations of glucose

表1 菌株SFD-1502葡萄糖、甘油雙碳源分段發(fā)酵結(jié)果Table 1 Two carbon source staged fermentation results of SFD-1502

a-底物消耗；b-細(xì)胞干重；c-油脂含量；d-DHA含量圖4 甘油補(bǔ)加時(shí)機(jī)對(duì)菌株SFD-1502發(fā)酵DHA的影響Fig.4 Effect of glycerol addition timing on DHA production by strain SFD-1502

2.3.2 雙碳源分段發(fā)酵初始葡萄糖濃度

分別采用20、40、60 g/L初始葡萄糖質(zhì)量濃度進(jìn)行細(xì)胞前期培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度降至10～5 g/L時(shí)分別補(bǔ)加100、80、60 g/L的甘油，發(fā)酵結(jié)果見表2。

表2 不同初始葡萄糖濃度對(duì)菌株SFD-1502雙碳源分段控制發(fā)酵的影響Table 2 Effect of different initial glucose concentrations on staged and controlled fermentation of strain SFD-1502 with two carbon sources.

初始葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，發(fā)酵液中的細(xì)胞干重以及DHA占總油脂的比例都顯著高于40、60 g/L的初始葡萄糖質(zhì)量濃度，只有細(xì)胞油脂含量略低于40、60 g/L的初始葡萄糖質(zhì)量濃度。同時(shí)，初始葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，補(bǔ)加甘油為100 g/L，培養(yǎng)120 h發(fā)酵液中已經(jīng)檢測(cè)不到甘油，說(shuō)明發(fā)酵周期也比單獨(dú)使用甘油短，充分發(fā)揮了雙碳源各自的優(yōu)勢(shì)。

2.3.3 5L發(fā)酵罐雙碳源分段控制發(fā)酵

為了進(jìn)一步充分顯現(xiàn)雙碳源分段控制發(fā)酵優(yōu)勢(shì)，采用5 L發(fā)酵罐(裝液量3.5 L)對(duì)上述控制策略進(jìn)行了放大實(shí)驗(yàn)。葡萄糖、甘油單一碳源發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。與搖瓶相比，5 L發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵周期明顯縮短了，細(xì)胞干重也略微提高，但細(xì)胞油脂含量和油脂中DHA含量都有所下降。

a-底物消耗和細(xì)胞干重；b-油脂含量和油脂中DHA含量圖5 菌株SFD-1502 葡萄糖、甘油5 L罐發(fā)酵進(jìn)程Fig.5 Fermentation process of SFD-1502 in 5 L bioreactor with glucose and glycerol

葡萄糖、甘油雙碳源分段控制發(fā)酵結(jié)果如圖6所示，以20 g/L的葡萄糖為初始碳源，培養(yǎng)約8 h發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度降至10～5 g/L，然后一次性補(bǔ)加100 g/L甘油，發(fā)酵進(jìn)程幾乎沒(méi)有延滯期，甘油被快速消耗，55～60 h碳源被完全消耗，發(fā)酵周期僅為搖瓶培養(yǎng)的1/2，油脂中 DHA比例最高達(dá)45.50%，雖然比甘油單一碳源略低，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葡萄糖發(fā)酵。

圖6 菌株SFD-1502雙碳源分段控制5 L罐發(fā)酵進(jìn)程Fig.6 Fermentation process of SFD-1502 in 5 L bioreactor with two carbon source added in segments

3 討論

工業(yè)發(fā)酵中最常用的碳源是葡萄糖，有時(shí)為了獲得更好的發(fā)酵結(jié)果，雙碳源、混合碳源也是不錯(cuò)的選擇[14]。使用混合碳源發(fā)酵時(shí)如果工藝控制得當(dāng)可顯著提高發(fā)酵效率，超出單一碳源發(fā)酵水平[15]。工藝控制策略因菌種、發(fā)酵產(chǎn)品和混合碳源而異。如白色鏈霉菌分批培養(yǎng)生產(chǎn)ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)，采用葡萄糖-甘油混合碳源與葡萄糖單獨(dú)發(fā)酵相比發(fā)酵周期顯著縮短[16]，相應(yīng)生物量和ε-PL的產(chǎn)率也有所提高。在木糖醇發(fā)酵過(guò)程中添加葡萄糖作為輔助碳源可以提高木糖轉(zhuǎn)化率[17]。通常，當(dāng)2種碳源混合培養(yǎng)時(shí)微生物會(huì)表現(xiàn)出2種類型的生長(zhǎng)行為：2種碳源依次被消耗(二次生長(zhǎng)現(xiàn)象)或同時(shí)被消耗(共同利用)[18]，但2種碳源互相抑制的報(bào)道較少。本文研究了裂殖壺菌SFD-1502利用葡萄糖和甘油發(fā)酵生產(chǎn)DHA的行為，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用葡萄糖作為碳源時(shí)，底物利用效率高，菌體生長(zhǎng)快，但油脂中DHA含量低；單獨(dú)使用甘油作為碳源時(shí)，底物利用效率相對(duì)較低，菌體生長(zhǎng)慢，但油脂中DHA含量高。為了促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和增加細(xì)胞油脂中DHA的含量，實(shí)驗(yàn)中采用葡萄糖和甘油混合發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖和甘油同時(shí)存在時(shí)，2種碳源的利用速率都明顯降低，總碳源消耗速率遠(yuǎn)低于單一碳源，說(shuō)明2種碳源存在相互抑制。LI等[12]在研究A.limacinumSR21利用甘油和葡萄糖混合發(fā)酵生產(chǎn)DHA時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖在25和50 g/L的時(shí)候補(bǔ)加甘油也會(huì)對(duì)底物消耗不利，這和我們的結(jié)果是一致的。轉(zhuǎn)錄組分析表明葡萄糖作為碳源可以激活糖酵解、磷酸戊糖2個(gè)代謝途徑，而甘油僅能激活甘油激酶途徑然后進(jìn)入糖酵解途徑[19]，因此葡萄糖消耗速度更快些，更利于菌體的生長(zhǎng)，甘油消耗速度慢，菌體生長(zhǎng)滯后。但甘油為碳源時(shí)可能激活了聚酮合酶途徑[8]，該途徑則有利于DHA的積累。當(dāng)葡萄糖和甘油同時(shí)存在時(shí)，裂殖壺菌會(huì)優(yōu)先利用甘油，甘油在甘油激酶的催化下磷酸化為3-磷酸甘油，3-磷酸甘油會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的活性，從而阻止了磷酸丙糖向磷酸己糖的快速循環(huán)，使磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑均受到抑制[20-21]，影響了葡萄糖的消耗；葡萄糖代謝中間產(chǎn)物1,6-二磷酸果糖也會(huì)抑制甘油激酶的活性，當(dāng)葡萄糖代謝旺盛時(shí)胞內(nèi)1,6-二磷酸果糖濃度增高，甘油激酶的活性受到抑制[22]，甘油消耗也會(huì)受到影響。以上可能是本文發(fā)現(xiàn)的葡萄糖和甘油同時(shí)存在時(shí)互相抑制的主要原因。葡萄糖和甘油分段發(fā)酵結(jié)果顯示當(dāng)葡萄糖耗盡后再添加甘油，甘油的消耗速度也比單獨(dú)使用甘油有所降低，進(jìn)一步對(duì)補(bǔ)加甘油時(shí)的葡萄糖濃度進(jìn)行了考查，發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為5～10 g/L時(shí)補(bǔ)加甘油，沒(méi)有出現(xiàn)碳源消耗抑制現(xiàn)象，可以充分發(fā)揮了雙碳源各自優(yōu)勢(shì)，獲得了非常理想的效果。LI等[11]都曾研究過(guò)葡萄糖、甘油雙碳源對(duì)異養(yǎng)微藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響，他們均設(shè)計(jì)了多種雙碳源添加方案，最后通過(guò)發(fā)酵篩選出最佳方案都比較復(fù)雜。他們都沒(méi)有對(duì)補(bǔ)加甘油時(shí)葡萄糖的濃度進(jìn)行關(guān)注和深入探究。本文研究發(fā)現(xiàn)控制相對(duì)較低的葡萄糖質(zhì)量濃度補(bǔ)加甘油可以獲得比較理想的結(jié)果，說(shuō)明甘油補(bǔ)加時(shí)機(jī)至關(guān)重要，這個(gè)現(xiàn)象是我們首先發(fā)現(xiàn)并明示的，關(guān)于這種現(xiàn)象的生物學(xué)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，裂殖壺菌SFD-1502以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)DHA，油脂中的DHA含量遠(yuǎn)低于以甘油為碳源發(fā)酵時(shí)，但甘油為碳源時(shí)底物發(fā)酵周期長(zhǎng)。為了充分發(fā)揮2種碳源各自優(yōu)勢(shì)，本文詳細(xì)研究了葡萄糖和甘油雙碳源發(fā)酵對(duì)SFD-1502生產(chǎn) DHA的影響。首先探討了葡萄糖和甘油的雙碳源按比例混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)甘油和葡萄糖同時(shí)發(fā)酵，2種碳源會(huì)相互抑制，生產(chǎn)效率比單一甘油碳源還要低；然后又嘗試先用葡萄糖促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，當(dāng)葡萄糖耗盡后再添加甘油，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘油消耗速度也低于單一甘油碳源。對(duì)甘油補(bǔ)加時(shí)機(jī)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖質(zhì)量濃度降為10～5 g/L時(shí)補(bǔ)加甘油可以獲得最佳效果。在5 L發(fā)酵罐中，初始葡萄糖質(zhì)量濃度設(shè)為20 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度降至10～5 g/L時(shí)補(bǔ)加100 g/L的甘油，發(fā)酵周期為55～60 h，油脂中 DHA含量45.0%左右。本文的雙碳源發(fā)酵控制策略簡(jiǎn)單，效果明顯，適合工業(yè)化推廣應(yīng)用。