誘變選育D-泛解酸內酯水解酶高產菌及發酵條件優化

沈治強，邢本，丁振東，楊靜文，胡雪芹，張洪斌

(合肥工業大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥，230601)

泛酸，也被稱為維生素B5，D構型的右旋泛酸為其活性成分，是動物體內合成乙酰輔酶A的重要前體物質，也是大多數天然食物中存在的必需微量營養素[1]，被廣泛應用于食品、藥品、飼料添加劑，其主要的產品形式為D-泛酸鈣，以及D-泛醇、D-泛硫乙胺等衍生產品。合成D-泛酸的關鍵在于拆分DL-泛解酸內酯獲得高光學純度的D-泛解酸內酯。傳統的方法是使用昂貴的手性試劑如奎寧、番木鱉堿、麻黃素等有機生物堿拆分[2]，但是該工藝帶來了嚴重的環境污染，并且拆分成本高。隨著人們對綠色環保生產的追求及生物酶法的興起，生物酶法拆分手性藥物中間體越來越受到關注。

通過酶法拆分DL-泛解酸內酯包括氧化還原酶法[3-4]和選擇性水解酶法[5-10]，另外還有用羥腈裂解酶不對稱加成法合成相對應的氰醇[11-13]等方法。而研究較多的是選擇性水解酶法，選擇性水解酶法是利用D-泛解酸內酯水解酶選擇性地將DL-泛解酸內酯中的D-泛解酸內酯水解成D-泛解酸，D-泛解酸在酸性條件下加熱得到D-泛解酸內酯，從而實現DL-泛解酸內酯的拆分。該方法不需要水解徹底，未水解部分經過消旋化處理可再次使用，只需所用的酶或微生物的立體專一性好，就能得到高光學純度的D-泛解酸內酯，相較于其他酶法拆分DL-泛解酸內酯，該方法是最具有應用價值的路線。SAKAMOTO等于1994年首次報道了用D-泛解酸內酯水解酶拆分泛解酸內酯的方法，并報道了該酶一般來源Fusarium、Cylindrocarpon和Gibberella[14-15]。研究篩選到一株產D-泛解酸內酯水解酶的菌株，經鑒定為串珠鐮孢霉菌(Fusariummoniliforme)SW-902，D-泛解酸內酯水解酶活力為0.92 U/g干菌體[5-7]。馬佳鵬[8]通過篩選得到一株具有D-泛解酸內酯水解酶活性的菌株Fusariumavenaceum3.4594，酶活力為0.489 U/mL。鄭莉莉[9]篩選得到一株具有D-泛解酸內酯水解酶菌株，經鑒定為尖鐮孢菌，并經過紫外誘變選育得到一株高活性菌株CZ-437，酶活力為5.7 U/L。王開放等[10]利用D380樹脂固定化D-泛解酸內酯水解酶，固定化酶的比酶活力為(11.5±0.12) U/g。

目前利用產D-泛解酸內酯水解酶的菌株催化拆分DL-泛解酸內酯所面臨的問題是原始來源菌酶活力較低，在工業上很難得到大規模應用。本實驗室篩選得到一株具有D-泛解酸內酯水解酶活性的菌株，經鑒定屬于鐮孢霉菌(Fusarium)，但是該菌株水解活力低，酶活力為1.42 U/mL，不利于大規模生產應用。為了提高其工業應用價值，本研究利用常溫室壓等離子(atmospheric room temperature plasma，ARTP)和UV-LiCl技術對產D-泛解酸內酯水解酶原始菌株進行多輪次遞進誘變，并結合平板變色圈大小初篩，搖瓶測酶活力復篩，以期獲得一株高產、穩定、適應性好的菌株，來提高生產效率以及降低生產成本，并對突變菌株進行發酵產酶條件優化。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

1.1.1 菌株來源與培養基

種子培養基(g/L)：酵母浸粉4,玉米漿干粉3.32,甘油13.32,棉籽蛋白胨13.32,豆粕粉6.68,消泡劑0.5,pH 7.0。

發酵培養基(g/L)：玉米漿干粉1.32,甘油6.6,棉籽蛋白胨5.28,豆粕粉6.6,消泡劑0.12,pH 7.5。

初篩培養基(g/L)：玉米漿干粉1.32,甘油6.6,棉籽蛋白胨5.28,瓊脂20,DL-泛解酸內酯15,溴百里酚藍0.1,pH 7.6。

菌種為本實驗室篩選得到并保存，經菌種鑒定屬于鐮孢霉菌屬。

1.1.2 試劑與設備

試劑：棉籽蛋白胨、豆粕粉、玉米漿干粉，南京茂捷微生物科技有限公司；酵母浸粉，OXOID公司；DL-泛解酸內酯，河南省新鄉六通實業有限公司；Tris，上海畢得醫藥科技有限公司；消泡劑，濟南翔邦化工有限公司；溴百里酚藍，天津市致遠化學試劑有限公司；LiCl、乙腈(分析純)，國藥集團。

Lab Alliance高效液相色譜系統，美國科學儀器公司；Alphasil VC-C18色譜柱，華普科儀科技有限公司；ZWYR-2102C恒溫培養振蕩器,上海智誠分析儀器制造有限公司；PHSJ-4F雷磁pH計,上海儀電科學儀器有限公司；WZZ-2S 2SS旋光儀，上海申光儀器儀表有限公司；常溫室壓等離子發射裝置，中國科學院合肥物質科學研究院提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵產酶方法

將4 ℃保存的斜面菌種，轉接至新鮮固體種子培養基上，27 ℃活化培養2 d，將活化后的菌落取一環轉入50 mL種子培養基，27 ℃、300 r/min，培養24 h，再將種子液以7.5%(體積分數)的接種量轉接至50 mL發酵培養基，27 ℃、300 r/min，培養36 h，發酵結束，抽濾并用去離子水洗滌，得到濕菌絲體。

1.2.2 孢子液的制備

取若干環生長3～4 d的固體培養基上的菌落，打入無菌生理鹽水中，充分振蕩，然后用一層無菌擦鏡紙過濾掉菌絲體，制成孢子濃度在105個/mL單孢子懸浮液。

1.2.3 誘變處理

ARTP誘變：取2 mL孢子懸液至無菌培養皿中，放置于常溫室壓等離子裝置探頭下，工作參數參考文獻[16]，工作氣體He，電壓12 kV，頻率100 kHz，室溫。處理時間分別為40、80、120、160、200、240、280 s。

UV-LiCl誘變：取2 mL孢子懸液至無菌培養皿中，在紫外燈下照射，照射距離為30 cm、功率為30 W，照射時間分別為20、40、60、80、100、120、140 s。

將誘變處理后的孢子液稀釋100倍，取0.3 mL涂布與初篩培養基(UV-LiCl誘變涂布于含6 g/L LiCl的初篩培養基)，27 ℃培養3～4 d，對照組的孢子懸浮液以同樣方法操作，待長出菌落，致死率按公式(1)計算：

(1)

1.2.4 初篩

在固體發酵培養基中加入DL-泛解酸內酯和pH指示劑，具有D-泛解酸內酯水解酶活力的菌株在培養基上生長，會水解培養基中的D-泛解酸內酯成D-泛解酸，導致菌落周圍pH下降，產生變色圈，變色圈和菌落直徑比值越大，酶活力可能越高[9]。將誘變處理后的孢子液涂布于初篩培養基，于27 ℃培養3～4 d，挑取變色圈/菌落直徑較大的菌落復篩。

1.2.5 復篩

將初篩挑取的變色圈/菌落直徑較大的菌株按照1.2.1步驟發酵培養，測其酶活力。

酶活力測定：取1 mL發酵液離心并用去離子水洗滌得到濕菌體，加入到2.5 mL 0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5),含6%DL-泛解酸內酯，30 ℃、150 r/min反應1 h，離心過濾除去菌體，采用液相色譜檢測反應液。

酶活力定義：30 ℃、pH 7.5條件下，每分鐘水解1 μmolD-(-)-泛解酸內酯成D-(+)-泛解酸所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

濕重定義:取1 mL發酵液離心并用去離子水洗滌，稱質量。

高效液相檢測條件為：色譜柱為Alphasil VC-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動相為V(乙腈)∶V(水)=25∶75，檢測波長215 nm，流速1 mL/min，進樣量20 μL。

突變菌株與對照菌株相比較，相對酶活力≤90%的為負突變株，相對酶活力≥110%的為正突變株，相對酶活力在90%～110%的視為中性突變株，并分別計算正突變率、負突變率和中性突變率。

1.2.6 高活性菌株遺傳穩定性

將篩選到的高活性突變株4 ℃斜面保存，每隔1周轉接活化1次，按照1.2.1步驟培養，測D-泛解酸內酯水解酶活力。

1.2.7 突變株與原始菌株催化高濃度DL-泛解酸內酯比較

欲提高突變菌株的工業應用價值，不僅要提高單位酶活力，也要提高其在高底物濃度下的水解能力以及對映體選擇性。隨著反應時間進行，該菌株催化的DL-泛解酸內酯水解反應的產物達到一定積累量，會抑制水解反應進行，使反應達到平衡。雖然提高底物濃度可以提高D-泛解酸的生成量，但是底物水解率會降低，導致大量底物未被利用，綜合考慮底物利用率及產物生成量，底物濃度為200 g/L時最佳。因此以20%的DL-泛解酸內酯為催化底物，分別加入1 g篩選得到的高活性菌株和原始菌株的濕菌體，30 ℃反應9 h，反應結束后，將反應液離心過膜，用旋光儀檢測其旋光度，液相檢測其水解率，以及將D-泛解酸內酯分離純化后測其光學純度，水解率和光學純度按公式(2)(3)計算：

(2)

(3)

式中：ρ0，反應前DL-泛解酸內酯濃度，g/L；ρ1，反應后DL-泛解酸內酯濃度，g/L。

1.2.8 突變株發酵產酶條件優化

相較于原始菌，突變株的基因組可能發生變化，原始菌株的發酵產酶條件不一定是突變株的最佳條件，因此對篩選到的高活性突變株，從發酵溫度(15～35 ℃)、發酵初始pH(6.0～9.0)、接種量(1.5%～16.5%)、發酵時間(12～96 h)幾個方面優化其發酵條件探究其對產D-泛解酸內酯水解酶的影響，每組做3個平行。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變最佳處理時間確定

如圖1所示，隨著處理時間增加，致死率逐漸增加，120 s時達到93.86%，280 s完全致死。當誘變時間短時，中性突變率較高；隨著致死率增加，突變概率逐漸增加，但是負突變率也對應增加。在處理時間為80 s時正突變率最高為28%，致死率為82.89%，這與文獻[17]中報道的致死率在80%左右更有利于篩選得到高產菌株相符合。

圖1 ARTP誘變時間對鐮孢霉菌致死率和突變率的影響Fig.1 Effects of ARTP mutagenesis time on the sterilization and mutation rate of Fusarium

2.2 UV-LiCl誘變最佳處理時間確定

將經紫外不同照射時間的孢子液涂布于含有6 g/L LiCl的初篩培養基上，誘變效果如圖2所示。當照射時間為60 s時致死率達到83.17%，140 s時完全致死。隨著照射時間的增加正突變率呈現先上升后下降的趨勢，在80 s時最大為20%，此時的致死率為88.78%。

圖2 UV-LiCl誘變時間對鐮孢霉菌致死率和突變率的影響Fig.2 Effects of UV-LiCl mutagenesis time on sterilization and mutation rate of Fusarium

2.3 初篩

在初篩培養基中加入底物DL-泛解酸內酯，相當于在篩選過程中給菌株一個脅迫作用，但是在培養基中加入DL-泛解酸內酯會抑制菌株生長。在初篩培養基中加入不同濃度DL-泛解酸內酯，27 ℃培養3 d，待菌落長出后計數，未添加DL-泛解酸內酯的作為對照，每組做3個平行，生長率按公式(4)計算：

(4)

如表1所示，DL-泛解酸內酯含量太低時起不到脅迫作用，含量太高篩選范圍小，因此選擇1.5%的添加量較合適，初篩培養基變色圈效果如圖3所示。

表1 DL-泛解酸內酯添加量對鐮孢霉菌生長的影響Table 1 Effect of DL-pantolactone addition on the growth of Fusarium

圖3 初篩培養基篩選效果Fig.3 Screening effect of primary screening medium

2.4 復篩

利用ARTP及UV-LiCl技術經過4輪誘變選育，以獲得高活性D-泛解酸內酯水解酶突變株，其中在在進行第二輪ARTP誘變時，正突變率及負突變率較第一輪均有所下降，第三輪采用UV-LiCl誘變以提高鐮孢霉菌對ARTP的敏感度，結果如表2所示，第四輪ARTP的突變率，較前三輪均有所增加。每一輪篩選出的高活性菌株如圖4所示。以每輪誘變篩選到的遺傳較穩定的高活性的菌株為出發菌株，再進行下一輪誘變(表2)。最終篩選得到一株高活性菌株4-80-6，其酶活力為3.51 U/mL。

表2 四輪誘變選育的過程Table 2 Process of four rounds of mutagenesis breeding

圖4 四輪誘變選育復篩菌株的酶活力Fig.4 Enzyme activity of re-screened strains selected by four rounds of mutagenesis

2.5 突變株的遺傳穩定性

經過誘變選育的突變株可能會出現自我修復，導致遺傳不穩定，因此對突變株4-80-6傳代培養8次，結果如表3所示。4-80-6菌株產酶活力比較穩定，其平均酶活力為3.46 U/mL，說明該突變株遺傳穩定，具有進一步研究的價值。

2.6 原始菌株與突變株4-80-6催化高濃度DL-泛解酸內酯的比較

以20%DL-泛解酸內酯為底物，比較突變株4-80-6與原始菌株的水解能力，結果如表4所示。在20%底物濃度下，突變株4-80-6水解率由原始菌株的11.6%提高到了17.7%。因為D-(-)-泛解酸內酯水解成D-(+)-泛解酸，旋光性由左旋變成右旋，而L-(+)-泛解酸內酯也是右旋的，反應越徹底，右旋的旋光值就越大。測定反應液的旋光值大小，可以觀察出菌體對底物的立體選擇性。突變株4-80-6反應液旋光度由原始菌的1.216提高到了2.785，說明突變菌株沒有改變其立體選擇性。產物的光學純度，由原始菌株的93.5%提高到了98.3%，表明該突變株對高濃度DL-泛解酸內酯的水解能力和對映體選擇性較原始菌株均有所提高，該突變株為工業上催化拆分DL-泛解酸內酯提供了更好的酶源。

表3 突變株4-80-6的遺傳穩定性Table 3 Genetic stability of mutant strain 4-80-6

表4 原始菌與突變株4-80-6催化DL-泛解酸內酯水解拆分的數據分析Table 4 Comparison of DL-pantolactone hydrolysis and resolution catalyzed by original strain and mutant strain 4-80-6

2.7 突變株4-80-6的發酵條件優化

2.7.1 發酵溫度對突變株4-80-6產D-泛解酸內酯水解酶的影響

如圖5所示，隨著發酵溫度增加，酶活力與發酵濕重均先增加后下降，在25 ℃時達到最佳，此時酶活力達到3.57 U/mL。而原始菌株的最佳培養溫度為27 ℃，說明突變株4-80-6較原始菌株更適合在低溫度下產D-泛解酸內酯水解酶。

圖5 發酵溫度對突變株4-80-6產D-泛解酸內酯水解酶的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature on the production of D-lactonohydrolase by mutant strain 4-80-6

2.7.2 發酵初始pH對突變株4-80-6產D-泛解酸內酯水解酶的影響

如圖6所示，隨著發酵培養基初始pH的增加，菌體濕重和酶活力均在pH為8.5時達到最佳，此時酶活力為4.01 U/mL，當pH升高到9.0時開始下降。而原始菌株的最適發酵初始pH為7.5，說明突變株4-80-6較原始菌株，更適合在偏堿性下產D-泛解酸內酯水解酶。

圖6 發酵初始pH對突變株4-80-6產D-泛解酸內酯水解酶的影響Fig.6 Effects of initial pH on the production of D-lactonohydrolase by mutant strain 4-80-6

2.7.3 接種量對突變株4-80-6產D-泛解酸內酯水解酶的影響

如圖7所示，隨著接種量的增加，酶活力和菌體濕重均在10.5%的接種量時達到最大，此時酶活力為4.12 U/mL，突變株4-80-6的最佳接種量由原始菌株的7.5%提高到了10.5%。

圖7 接種量對突變株4-80-6產D-泛解酸內酯水解酶的影響Fig.7 Effects of inoculation volume on the production of D-lactonohydrolase by mutant strain 4-80-6

2.7.4 原始菌和突變株4-80-6的發酵時間曲線

按照上述優化的條件發酵培養，每隔6 h測酶活力和濕重，以及測發酵液pH。如圖8所示，酶活力和發酵濕重隨著發酵時間增加均出現先上升后下降的趨勢，突變株4-80-6在48 h達到最佳，此時酶活力為4.33 U/mL，菌體濕重為0.075 g/mL。原始菌株在36 h達到最佳，此時酶活力為1.42 U/mL，菌體濕重為0.073 g/mL。突變株4-80-6達到最佳發酵時間由原始菌株的36 h延長到了48 h，說明該突變株較原始菌株生長緩慢些。

圖8 原始菌株與突變株4-80-6發酵時間曲線Fig.8 Fermentation time curve of original strain and mutant strain 4-80-6

如圖9所示，隨著發酵時間的增加，發酵液pH先下降后上升，突變株4-80-6在48 h下降到最低4.94，原始菌株在36 h下降到最低5.1。pH變化趨勢與菌株生長趨勢相符合，前期菌體生長消耗培養基成分使培養基pH下降，當菌體生長到一定程度，菌體開始出現裂解，菌體自身代謝物質釋放使pH上升。

圖9 原始菌株與突變株4-80-6發酵液pH值變化曲線Fig.9 pH value curve of fermentation of original strain and mutant 4-80-6

3 結論

以產D-泛解酸內酯水解酶的鐮孢霉菌為基礎，利用ARTP和UV-LiCl技術經過4輪遞進誘變，并結合平板變色圈大小初篩，搖瓶測酶活力復篩，篩選得到1株優勢菌株4-80-6，酶活力為3.46 U/mL，是原始菌株的2.43倍，8次傳代培養后，該菌株遺傳穩定。以20%的DL-泛解酸內酯為底物催化時，突變株4-80-6較原始菌株，水解率提高了47.41%，光學純度由93.5%提高到了98.3%。通過對突變株4-80-6發酵產酶條件的優化，酶活力達到4.33 U/mL，比優化前(3.46 U/mL)提高了25.14%。

本研究在多輪ARTP誘變中穿插一輪UV-LiCl誘變，其目的為了防止鐮孢霉菌對ARTP產生耐受性，提高其對ARTP的敏感度，增加突變概率。從突變率和致死率的結果可知，當致死率較低時，突變概率小，產生的大多都是中性突變；致死率較高時，突變概率增加，負突變率會相應增加，并且致死率太高篩選范圍較小。本研究中無論是ARTP誘變還是UV-LiCl誘變，均是在致死率為80%～90%時，正突變率最高，這與文獻[17]報道的致死率在80%左右更有利于篩選到優勢菌株一致。篩選到的突變株4-80-6，不僅酶活力較原始菌株有所提高，在20%底物濃度下水解率也高于原始菌株，同時所得到的產物D-泛解酸內酯的光學純度也有所提高，以及通過發酵條件優化，進一步提高了其酶活力，為工業上拆分DL-泛解酸內酯提供了更好的酶源。

致謝

感謝中國科學院合肥物質科學研究院黃青研究員提供常溫室壓等離子設備與技術支持。