高產輔酶Q10類球紅細菌的選育及發酵優化

李文鑫，曾偉主，周景文,3*

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122)

輔酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)是一種脂溶性醌類化合物。作為天然存在的輔酶，CoQ10是人體必需的抗氧化劑和電子傳遞體，在呼吸作用中是非常關鍵的物質，能夠增強胞內ATP的供給，降低體內自由基，抵抗氧化，幫助延緩衰老，提高機體免疫力[1]。CoQ10在食品、醫藥、化妝品和畜牧飼料領域有廣泛應用，市場需求和技術應用日趨增加[2-3]。目前，CoQ10的生產方法主要是發酵法，該方法不僅僅可以擴大生產規模，在生產力層面占據優勢，又因其是微生物自身合成的產物，CoQ10的下游產物均是具有良好生物活性的反式結構，相比于動植物組織提取法和化學合成法，發酵法生產成本更有競爭力[4]。類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)是一種古老的原核生物，廣泛存在于農田、池塘、湖泊和海洋中。類球紅細菌具有多種代謝途徑，如光能自養、光能異養和化能異養。同時，類球紅細菌可以利用多種小分子有機物為碳源合成增值產品，如微生物蛋白、類胡蘿卜素、細菌葉綠素、CoQ10和長鏈游離脂肪酸等[5]。

CoQ10合成途徑較為復雜，當前主要針對其合成關鍵機理及其限速酶進行解析，通過代謝途徑和基因表達元件的調控等方式提高CoQ10效價[6-7]。目前，國內CoQ10的生產效率并不能滿足當前我國日益增長的需求，國內外多采用誘變育種和發酵過程優化來強化CoQ10的生產[8]。選育高產量的CoQ10生產菌是當前亟待解決的問題。常用的菌株誘變育種方法包括物理誘變和化學誘變[9-10]。近年研究中，常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)技術因具有高突變率、低危險性及操作便利性等優勢，在國內誘變研究工作中獲得了更多青睞，如維生素K、吡咯喹啉醌和輔酶等重要物質高產菌株的篩選研究進展迅速[11-12]。但是，誘變篩選的過程常常難以控制，菌株隨機突變而導致篩選過程難以實現高效率和高正向突變率的問題仍然存在[13]。近年來，高通量篩選方法因其高自動化和高效率的特點迅速崛起，此類平臺為CoQ10高產菌株的高效篩選提供了新思路[14-15]。能夠簡便而快速篩選到更多正向突變菌株的篩選方法亟待被開發，用以應對CoQ10高產菌株的研究工作。

本研究以類球紅細菌作為出發菌株，應用Craven test法以堿性環境下CoQ10上甲氧基和氰基的配合物在熒光條件下能夠快速檢測的原理為基礎，確定了多孔板初篩高產CoQ10菌株的方法，采用ARTP誘變技術結合篩選因子維生素K3、對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid，PHBA)和羅紅霉素(roxithromycin，ROX)進行多輪誘變和發酵培養復篩，獲得1株高產CoQ10的突變菌株，考察其遺傳穩定性，并在搖瓶水平進行培養基成分和濃度的優化，最后在5 L發酵罐中進一步優化發酵條件，以強化類球紅細菌的生產性能。該研究亦可為其他維生素的高產菌株的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

出發菌株為類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)，由本實驗室保藏。

1.1.2 菌株培養基

平板培養基(g/L)：酵母粉15.0，KH2PO41.0，NaCl 2.0，FeSO4·7H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO40.09，CoCl20.003，氯化膽堿0.012 12，瓊脂粉18.0，pH 7.0～7.2。121 ℃滅菌20 min。

種子培養基(g/L)：(NH4)2SO42.5，酵母粉1.0，谷氨酸鈉0.5，玉米漿干粉0.5，葡萄糖4.0，KH2PO40.5，K2HPO40.5，NaCl 2.0，FeSO4·7H2O 0.1，MgSO4·7H2O 2.0，MnSO40.03，CoCl20.001，CaCO38.0，氯化膽堿0.004，pH 6.6～7。115 ℃滅菌20 min。

發酵培養基(g/L)：(NH4)2SO42.5，谷氨酸鈉2.5，玉米漿干粉3.5，KH2PO40.45，NaCl 2.0，FeSO4·7H2O 1.2，MgSO4·7H2O 11.0，MnSO40.05，CaCl20.07，CaCO38.0，氯化膽堿0.002 8。121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基輔料(g/L)：維生素B10.605，維生素B20.060 5，維生素B60.111 3，煙酸0.687 5，煙酰胺0.687 5，葉酸0.033，泛酸鈣0.011，生物素0.021 7，0.22 μm水系膜過濾。

1.1.3 主要試劑和主要儀器

硫胺素、生物素、煙酸、PHBA、維生素K3、ROX、CoQ10標準品、DMF、甲醇、乙醇(色譜純)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；谷氨酸鈉、NaOH、(NH4)2SO4、CaCO3、FeSO4、MnSO4、CoCl2、無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司；玉米漿干粉，上海源葉生物有限公司。

ZQZY-80AS搖床，上海知楚儀器有限公司；LC-6AD高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；Nanodrop ND-2000分光光度計，美國Thermo公司；Applied Biosystems臺式離心機，美國Eppendorf公司；ARTP-IIS常壓室溫等離子體誘變儀，無錫源清天木生物科技有限公司；synergy H1酶標儀，南京拜爾沃克智能科技有限公司；T&J-TypeA 5L發酵罐，迪必爾生物工程(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ARTP誘變處理

采用ARTP育種儀對出發菌株R.sphaeroides進行誘變。誘變條件：等離子體的輸出功率為120 W；氦氣流速為10 L/min；等離子體激發器與樣品之間的距離為2 mm；突變細菌的懸浮液體積為10 μL；將10 μL細菌懸浮液鋪在無菌不銹鋼載片上(ARTP儀器配件)。誘變處理不同時間：從0 s開始，每一次增加30 s，最長的處理時間為150 s。誘變后，將包含細菌懸液的整個載片放入含有1 mL無菌生理鹽水的2 mL無菌EP管中。用渦旋振蕩器洗脫2 min后，梯度稀釋后取100 μL菌溶液，涂在含有篩選因子的平板培養基上，在生化培養箱中于32 ℃孵育3 d，觀察平板上菌落的生長情況并計算致死率。

1.2.2 致死率測定

取經過ARTP不同照射時間處理后的稀釋10-4、10-5梯度的平板培養基(每個梯度進行3組重復)，分別統計菌落個數，按照公式(1)計算致死率：

(1)

式中：在同一稀釋梯度下，N，未經誘變的空白對照平板上長出的單菌落個數；M，經過誘變處理后的平板上長出的單菌落個數。

1.2.3 高通量篩選方法

按照所選用90～120 s的時間進行ARTP誘變處理，處理完畢的菌懸液用無菌生理鹽水稀釋，然后吸取100 μL，涂布于含DMF、PHBA、ROX、維生素K3的篩選平板中，各3個平行，32 ℃靜置避光倒立培養，3～8 d觀察并統計單菌落數。通過比較突變菌株生長的菌落大小，挑選飽滿的單菌落接種孔板篩選，平板劃線保存。

將成熟后的單菌落挑選于含有1 200 μL種子培養基的48深孔板中，在32 ℃、220 r/min培養28 h，以10%的接種量轉接于含有1 200 μL液體篩選培養基的24深孔板中，在32 ℃、220 r/min條件下培養48 h。從多孔板培養中取發酵48 h的發酵液至24深孔板中，提取CoQ10后吸取400 mL提取液與1 mL的體積分數0.5%的KOH以及1 mL氰基乙酸乙酯(ethyl cyanoacetate，ECA)充分混合，避光條件下25 ℃靜置30 min后，吸取200 μL轉移到96淺孔板中，使用酶標儀檢測在λex/λem=430/530 nm處的熒光值，檢測同樣條件下的培養基，扣除培養基背景噪音，熒光值越高表明CoQ10量越高，挑取高于對照10%以上的優勢菌株復篩。

搖瓶水平復篩后選取的優勢菌株檢測效價，挑取高于對照10%以上的優勢菌株-80 ℃保存。進行傳代培養，成熟后進行搖瓶篩選,將確定了遺傳穩定性的高產菌株進行-80 ℃保存。

1.2.4 液相檢測條件

CoQ10的提取：取1 mL發酵液于1.5 mL的EP管中，加入20 μL的HCl溶液，2 mL丙酮，100 μL的H2O2，補充無水乙醇定容至10 mL，超聲波提取45 min后，用0.22 μm有機濾膜過濾，吸取1 mL置于液相進樣瓶中進行液相檢測，根據標準曲線計算發酵液效價。

采用HPLC檢測發酵液中CoQ10的效價。色譜柱：Diamonsil 5 μm C18 150 mm×4.6 mm，檢測條件：流動相為V(無水乙醇)∶V(無水甲醇)=35∶65等速洗脫，洗脫流速為1.1 mL/min，吸收波長為275 nm，柱溫為35 ℃，進樣量20 μL。

1.2.5 搖瓶培養方法

將安瓿管中菌粉用培養基混勻后于32 ℃，220 r/min振蕩培養，待菌株長至對數期進一步平板劃線進行活化，32 ℃培養6～7 d。劃線接種搖瓶種子32 ℃、轉速220 r/min培養30 h，按10%(體積分數)接種量接入搖瓶發酵，于32 ℃、轉速220 r/min下培養48 h，采用單因素試驗確定碳源、PHBA、金屬離子的最佳組合。

1.2.6 5 L發酵罐培養條件

在搖瓶水平得到的最優培養基的基礎上，在5 L發酵罐上進行驗證培養。通氣量1 vvm，轉速400 r/min，5 L發酵罐初始裝液量為2.5 L，控制發酵罐內的葡萄糖質量濃度在5～12 g/L，用氨水維持pH為6.8。觀察發酵過程中菌株的生長情況及CoQ10的合成情況。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變致死曲線的繪制

ARTP誘變育種技術使用等離子體對菌體內P—O鍵、C—N鍵等關鍵位置進行破壞，因此，微生物經過誘變處理后會大量死亡，但少部分存活的菌株會通過自身修復系統實現一定的修復作用，從而導致基因突變[16]。通過平板計數法計算類球紅細菌的ARTP致死率，計算不同誘變時間處理后涂板所獲得的菌落數，計算ARTP誘變致死率，繪制致死率曲線，結果如圖1所示。對R.sphaeroides菌懸液處理時間從0～150 s，處理90 s后致死率達到了90%以上，處理150 s致死率達到95%以上。通常情況下，致死率越高時，菌株發生突變的概率越高，致死率達到85%～90%時較為合理[17]。因此，為了高效獲得突變菌庫，本研究選擇處理時間120 s(90%左右的致死率)作為誘變劑時間，進行誘變處理。

圖1 致死曲線Fig.1 The lethality curve

2.2 高產菌株誘變篩選方法與初篩

目前，CoQ10常用的檢測方法包括高效液相色譜法、分光光度法、Craven test法。高效液相色譜法檢測精準性高、范圍廣，但并不適用于高通量篩選檢測。分光光度方法存在準確度不高和重復性較差等問題。本研究采用Craven test法，CoQ10的一個甲氧基被ECA的一部分取代，產生的化學衍生物可以在λex/λem=430/530 nm處通過熒光分光光度計檢測[18]。如圖2所示，使用Craven test法處理CoQ10的標品，避光條件中靜置2 h后用酶標儀檢測λex/λem=430/530 nm(檢測CoQ10的終質量濃度分別為100、200、500、800、1 000 μg/mL)獲得標準曲線y=3.299+364.57x(R2=0.998)。在100～1 000 μg/mL二者呈現良好的線性關系。因此使用本方法進行高通量篩選的初篩具有良好的可行性。

圖2 Craven test法檢測CoQ10的標準曲線Fig.2 Standard curve of coenzyme Q10 detected by Craven test method

通過培養平板中添加篩選因子，可以提高篩選正向突變的效率[19]。維生素K3是脂溶性物質，本實驗使用DMF作為有機溶劑對其進行溶解。由表1可知DMF體積分數在0%～2.5%時對菌體的生長基本上沒有影響，而體積分數超過7.5%時會對菌體生長產生明顯抑制，因此，DMF的體積分數上限定為5.0%。

維生素K3是CoQ10的結構類似物，可用于篩選解除CoQ10產物抑制的菌株[19]。由表1可知，當維生素K3質量濃度在0.003～0.003 5 g/L時，平板上菌落正常，但隨著維生素K3濃度的增加，菌落數減少;當質量濃度達到0.004 g/L時，由于受維生素K3的抑制作用比較明顯，平板上無菌落生長。因此，確定篩選抗結構類似物突變株所用抗性平板中維生素K3質量濃度為0.003 5 g/L。

PHBA是CoQ10合成的重要前體物質，用于篩選解除前體抑制的菌株。由表1可知，隨著PHBA濃度的增加，菌體的生長受到抑制逐漸加重，當質量濃度達到0.06 g/L時，沒有菌落生長。因此，確定PHBA的最小抑制質量濃度為0.05 g/L。

ROX易與氧分子結合發生電荷轉移形成超氧陰離子,用于篩選合成CoQ10能力強的菌株。由表1可知，隨著ROX濃度的增加，菌體的生長抑制逐漸加重，當質量濃度達到0.007 5 g/L時，少有菌落生長。因此，確定ROX的最小抑制質量濃度為0.005 g/L。

表1 平板篩選因子濃度對菌體生長的影響Table 1 Effect of plate screening factor concentration on cell growth

本研究應用ARTP誘變處理CoQ10生產菌株R.sphaeroides，進行誘變處理，在孔板初篩階段共進行6輪次的誘變處理，獲得5 184株菌的突變菌庫。使用本研究確立的高通量篩選方法獲得126株正向突變的高產菌株(圖3)從中選取孔板初篩效價提高12%以上的8株突變株進行下一步的搖瓶水平復篩，分別命名為64p12、622v22、61p20、7r16、64p5、7p22、61r21和521p10。

圖3 ARTP誘變初篩Fig.3 Primary screening with ARTP mutation

2.3 高產菌株的復篩與穩定性分析

將活化好的8株突變菌株進行搖瓶發酵復篩，以10%接種量轉接至裝有發酵培養基的250 mL搖瓶中，32 ℃、220 r/min條件下培養48 h，使用HPLC檢測CoQ10。復篩結果如圖4所示，獲得高產菌株7p22，CoQ10的效價158.44 mg/L較出發菌株(136.47 mg/L)提高了16.1%。

圖4 搖瓶復篩Fig.4 Second screening in the shake flasks注：WT代表原始出發菌株(下同)

為了驗證突變菌株的遺產穩定性，在搖瓶上高產菌株進行連續傳代6次，以出發菌株為對照。對其中第1代、第3代和第6代進行搖瓶發酵，檢測突變菌株的CoQ10發酵能力。結果如表2所示，傳代至第4代時，突變體積累CoQ10的效價變化不明顯。突變菌株積累的CoQ10的產量與第1代和第6代的產量基本相當。搖瓶驗證結果表明3株高通量篩選獲得的突變菌株具有穩定的遺傳特性。

表2 突變菌株遺傳穩定性Table 2 The genetic stability of mutant strains

2.4 搖瓶發酵培養基成分的優化結果

2.4.1 不同碳源條件對CoQ10的影響

在搖瓶水平上本研究選擇了葡萄糖、麥芽糖、乙酸鈉、果糖、甘油、蔗糖作為碳源，探究了幾種不同的廉價碳源對CoQ10的影響，結果如圖5所示，葡萄糖作為速效碳源時CoQ10產量最高可達143.4 mg/L (圖5-a)，有利于菌體的迅速生長(圖5-c)。葡萄糖初始質量濃度添加量為30 g/L時更有利于CoQ10產物生產(圖5-b、圖5-d)。

a-碳源種類對CoQ10產量的影響；b-葡萄糖初始質量濃度對CoQ10產量的影響；c-碳源種類對生物量的影響；d-葡萄糖初始質量濃度對生物量的影響圖5 不同碳源下CoQ10的產量及OD600值Fig.5 OD600value and CoQ10 titer of different carbon sources

2.4.2 不同濃度的PHBA對CoQ10的影響

本研究考察了不同濃度PHBA對和CoQ10合成的影響，結果如圖6所示。初始添加質量濃度為37.5 mg/L時CoQ10產量達到93.8 mg/L，比對照組(73.8 mg/L)產量提升27.1%。當初始添加質量濃度超過50 mg/L時，前體物質抑制對菌體生長及CoQ10的產量有明顯的影響，與前期篩選因子的選擇實驗結果吻合。因此選擇初始添加PHBA質量濃度為37.5 mg/L更有利于CoQ10的合成。

圖6 不同濃度PHBA對CoQ10產量的影響Fig.6 Effect of different concentrations of p-hydroxybenzoic acid on titer of CoQ10

2.4.3 不同濃度的金屬離子對CoQ10的影響

對發酵培養基無機鹽進行單因素試驗，確定發酵CoQ10各種無機鹽的最適質量濃度范圍，從圖7中可以確定4種無機鹽對CoQ10產量最適質量濃度分別為25、1.2、0.3和2.5 g/L。無機鹽主要為微生物提供滲透壓等環境，同時，許多鹽離子作為重要的某些酶的酶活中心，能夠明顯地影響細胞的生長以及目標產物的合成，因此無機鹽的濃度對微生物生長及合成CoQ10的影響同樣很大。

2.5 5 L發酵罐優化

2.5.1 分批發酵

搖瓶階段的發酵難以針對pH值、溫度、溶氧等關鍵的發酵因素進行及時的檢測與調節，5 L發酵罐更適合于滿足菌體生長的需要。因此本研究探索在5 L發酵罐階段中，分批發酵的策略培養類球紅細菌，給后續實驗提供經驗。

發酵過程中菌體濃度、葡萄糖濃度以及CoQ10合成情況的變化，如圖8所示。發酵60 h后停止發酵，OD600最高達到35.64，CoQ10產量達到256.6 mg/L。10 h后菌體生長進入對數期，葡萄糖被快速消耗，到40 h后葡萄糖被耗盡，菌體也隨即停止生長，說明在分批發酵中葡萄糖是菌體生長和產物合成的限制性因素。

a-MgSO4·7H2O；b-FeSO4·7H2O；c-KH2PO4；d-NaCl圖7 金屬離子濃度對CoQ10產量的影響Fig.7 Effect of metal ions concentration on titer of CoQ10

圖8 5 L罐上分批發酵過程曲線Fig.8 Batch fermentation process curve on 5 L bioreactor

2.5.2 連續流加補料發酵

分批補料發酵方式生產CoQ10可以減少發酵過程中底物過分消耗和代謝副產物積累對CoQ10的不利影響。應用恒定殘糖濃度流加的方法，根據上一時間段的耗糖速率預測下一時刻的耗糖速率，從而將葡萄糖流速調至最適范圍內，保持糖濃度的相對恒定。如圖9所示，流加葡萄糖的補料分批發酵結果，碳源的流加補料延長了菌體的生長時間，60 h后OD600達116.8，此時CoQ10產量達973.61 mg/L。發酵50 h后，菌體生長逐漸緩慢，但單細胞耗糖速率保持較高水平，說明其他限制因子可能對菌體生長有影響。

圖9 5 L罐上流加葡萄糖的補料分批發酵過程曲線Fig.9 Fed-batch fermentation with glucose feeding fermentation process curve on 5 L bioreactor

2.5.3 溶氧(dissolved oxygen,DO)水平對CoQ10的影響

類球紅細菌在發酵過程中對氧氣的需求比較嚴格。過低的DO會導致菌體生長代謝受阻；而過量的氧會形成超氧化物O2-和過氧化物基O22-，破壞細胞組分，進而影響微生物生長[20]。為了確定發酵過程中最佳的DO條件，在其他條件不變的情況下，分別設置DO為5%和25%進行實驗，通過溶氧偶聯發酵罐的攪拌轉速來研究DO對CoQ10發酵的影響。圖10顯示，DO為5%時，OD600和CoQ10最高達到134和1 411.05 mg/L，相較于DO為25%時，OD600和CoQ10分別為220和1 006.48 mg/L，低溶氧條件下，更利于發酵CoQ10的合成，高溶氧條件下，明顯更利于菌體快速生長，但高溶氧對后期CoQ10的生產不利，具有抑制作用，與YOUSHIDA等[21]的報道基本符合。

a-DO=5%；b-DO=25%圖10 不同DO條件對CoQ10產量的影響Fig.10 Effect of different DO conditions on titer of CoQ10

2.5.4 補加無機磷對CoQ10的影響

磷元素在細胞代謝途徑調節方面有著關鍵的作用，它不僅促進微生物生長，也能夠為一些產物的提升做出貢獻。CoQ10發酵過程中，通常選擇流加高濃度的KH2PO4的方法來控制發酵液中磷元素的質量濃度為0.1～0.2 g/L。發酵過程中根據菌體的耗糖情況對流加速率做適當調整，控制葡萄糖質量濃度水平在5～10 g/L。由圖11可知，菌體生長在72 h時達到對數生長后期，由于磷酸鹽的加入使得菌體的生長周期延長，并且更有利于CoQ10的積累，于84 h時獲得最高OD600達到172。發酵液CoQ10的產量為1 640.6 mg/L，比較不流加磷酸鹽時CoQ10的產量顯著提高。

圖11 連續流加分批發酵過程曲線Fig.11 Continuous flow plus batch fermentation process curve

3 結論與討論

CoQ10作為一種呼吸鏈傳遞系統的必需輔助因子，廣泛應用于食品、醫藥、農業等行業。雖然在基因工程方面取得了一定的進展，如XU等[22]分析了類胡蘿卜素途徑和限速酶對CoQ10生產的影響；LU等[23]鑒定并消除泛醌修飾途徑中的代謝瓶頸強化CoQ10的生產。但是CoQ10的合成途徑復雜，通過基因工程獲得CoQ10高產的菌株相對比較困難。目前主要是通過誘變育種和發酵工藝的優化強化生產，如梁琳琳[24]對RhodopseudomonaspalustrisFM-01-12進行復合誘變和發酵優化后在50 L發酵罐上獲得3 158 μg/mL的產量。ZHANG等[25]通過磷酸鹽限制與葡萄糖補料分批發酵相結合的策略，R.sphaeroidesATCC BAA-808在100 L發酵罐上將CoQ10的產量提升至1.95 g/L。

本研究應用常溫室壓ARTP對CoQ10生產菌株R.sphaeroides進行誘變處理，針對CoQ10的特性確定了借助維生素K3、PHBA、ROX作為篩選因子的篩選手段，結合Craven test檢測方法應用ECA堿性條件下在酶標儀中快速地對CoQ10的檢測功能，對5 184株誘變菌株庫進行分選、檢測。從分選出的8個正向突變株中選取了1株CoQ10高產菌株7P22，相比于初始菌株提升了16.1%，遺傳穩定性良好。針對篩選得到的高產菌株進行了搖瓶水平上的碳源、前體物質PHBA及金屬離子的成分優化，將突變菌株和優化后的發酵培養基在5 L發酵罐上進行放大培養并對發酵罐水平的發酵條件進行優化，發酵84 h后CoQ10產量達到1 640.6 mg/L。本研究針對誘變育種的高通量篩選方式和發酵優化的方法對高產CoQ10的菌株進行研究，今后的研究可以尋找代謝途徑關鍵的前體物質、氧化性強等產物針對性明顯的細胞毒性物質作為正向突變菌株篩選因子，作為高產CoQ10的菌株選育的理性基礎。結合流式細胞分選技術等更大規模高自動化的先進技術提高篩選通量，從而更高效的篩選高產突變株，進入工業菌株選育研究模式的更高層次，從而應對社會對CoQ10等高價值維生素的需求；另外，5 L發酵罐的溶氧、尾氣、罐壓等參數的檢測條件有限，今后的研究可以在更大規模的發酵罐中進行優化，并結合氧傳遞系數(KLa)進行優化，從而進步強化CoQ10的積累。