異丙酚通過下調(diào)ERK-VEGF/MMP-9信號通路對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響及機制研究*

許思貴，莫懷忠，向梅，王德莉

（1.貴州醫(yī)科大學 麻醉學院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 麻醉科，貴州 貴陽 550000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球第二致死性惡性腫瘤[1]。目前，肝癌的臨床治療方案主要包括常規(guī)化療、手術(shù)切除、肝移植、射頻消融、經(jīng)導管動脈化療栓塞等[2]。盡管近年來肝癌的診斷和治療有了較大的進步，但由于肝癌患者術(shù)后復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率均較高，其遠期預后和生存率仍然不理想[3]。異丙酚作為癌癥手術(shù)最常用的麻醉藥物之一，其可通過下調(diào)ERK-VEGF/MMP-9 信號通路抑制直腸癌、食管癌等消化系統(tǒng)腫瘤的進展[4-5]。研究[6]報道，異丙酚還可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路抑制肝癌細胞的發(fā)生發(fā)展。此外，也有研究[7]報道，異丙酚抑制肝癌細胞的進展過程可能與其調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路有關(guān)。然而，異丙酚是否還通過其他通路對肝癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響還有待進一步研究。研究表明，VEGF 和MMP-9 的表達與肝癌細胞血管生成和侵襲能力的關(guān)系十分密切[8-9]。故本研究通過檢測ERK-VEGF/MMP-9 信號通路關(guān)鍵蛋白的表達，進一步深入探討異丙酚對肝癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響，為異丙酚麻醉下肝癌手術(shù)治療的優(yōu)勢提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肝癌HepG2 細胞（上海富衡細胞庫），DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶（北京賽澳美細胞技術(shù)有限公司），異丙酚（英國阿斯利康制藥有限公司），二甲基亞砜（DMSO）（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8 溶液（美國Apexbio 公司），胎牛血清（上海吉泰依科賽生物科技有限公司），Transwell 小室、Matrigel 膠（美國康寧公司），Western blotting 所用的一抗、ECL 試劑（江蘇親科生物研究中心有限公司），二抗（美國EarthOx 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

將含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基6 mL 加入培養(yǎng)皿中，然后將人肝癌HepG2 細胞以適當?shù)拿芏冉臃N于皿中，在濕度合適、37℃、5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當單層培養(yǎng)融合超過90%時，通過胰酶適度消化，然后進行細胞傳代培養(yǎng)。將異丙酚溶解于DMSO 中，用不含血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋異丙酚，以不同濃度（0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 和20 μg/mL）異丙酚處理HepG2 細胞48 h，并以相同濃度的DMSO 處理HepG2 細胞作為陰性對照組（DMSO 組），以DMEM 培養(yǎng)基和CCK-8 溶液處理HepG2 細胞作為空白對照組。

1.3 CCK-8 實驗檢測異丙酚處理后的HepG2 細胞活性

將細胞以每孔2×103個/mL 的密度接種于96 孔板中過夜后，用DMSO 及0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL 異丙酚處理48 h 后，首先用純培養(yǎng)基將CCK-8 溶液配成10%的溶液，棄去舊培養(yǎng)基，然后在孔板中加入10% 的CCK-8 溶液，100 μL/孔，避光培養(yǎng)1～2 h，測定細胞在450 nm波長處的光密度（OD）。增殖率（%）=（OD藥物組-OD空白對照組）/（OD陰性對照組-OD空白對照組）×100%。

1.4 劃痕實驗

將細胞接種于6 孔板中，每孔5×105個細胞，培養(yǎng)至細胞單層融合，用200 μL 槍頭尖端沿著直尺垂直于板中央劃一條直線，沿著孔壁加入磷酸鹽緩沖液（PBS），洗滌2 遍，加入相應濃度的異丙酚，培養(yǎng)48 h 后用倒置顯微鏡觀察3 個視野下劃痕面積。在0 h、48 h 采集圖像，使用Image J 軟件計算劃痕面積。細胞遷移率（%）=（初始劃痕面積-48 h劃痕面積）/初始劃痕面積×100%。

1.5 Transwell 侵襲實驗評估HepG2 細胞的侵襲能力

首先將Matrigel 基質(zhì)稀釋到合適濃度后鋪于小室，置于培養(yǎng)箱保存2 h，待其凝固，將不同濃度的異丙酚處理的HepG2 細胞（2×105個/mL）接種到Transwell 小室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL，在37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，用棉簽蘸去上室內(nèi)側(cè)面貼壁細胞，將侵襲穿過的細胞小室置于24 孔板內(nèi)，加入4%多聚甲醛，放入37℃培養(yǎng)箱中固定30 min，再將小室置于盛有0.1%結(jié)晶紫染液的孔內(nèi)，放入37℃培養(yǎng)箱中染色20 min，PBS 洗3 遍，顯微鏡下隨機取5 個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.6 Western blotting 檢測MMP-9、VEGF、ERK及p-ERK蛋白相對表達量

HepG2 細胞在裂解前分別用DMSO、0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL 的異丙酚處理48 h。加入RIPA 裂解液，提取總蛋白，BCA 標準蛋白定量化測定蛋白濃度。然后進行SDS-PAGE（10%）凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉（5%，1 h）封閉后，分別將膜與GAPDH（1∶5 000）、MMP-9（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000）、ERK（1∶3 000）及p-ERK（1∶1 000）一抗溶液混合均勻，置于4℃冰箱里面的搖床上晃動孵育過夜，TBST 洗膜，用HRP 標記的二抗（1∶20 000）孵育1 h，TBST 洗 膜，使 用ECL 試劑對 條帶顯 影，以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析條帶。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 異丙酚抑制HepG2細胞增殖

CCK-8 實驗結(jié)果顯示，空白對照組、DMSO 組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組細胞增殖率分別為（100.00±3.79）%、（99.70±7.75）%、（84.76±4.24）%、（73.34±4.29）%和（59.80±4.79）%，空白對照組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組和20 μg/mL 組增殖率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=56.096，P=0.000），5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 細胞增殖率較空白對照組降低（P<0.05），且隨著異丙酚濃度升高，HepG2 細胞增殖能力降低，呈現(xiàn)濃度依賴性。DMSO 組細胞增殖率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度異丙酚對HepG2細胞增殖的影響

2.2 異丙酚抑制HepG2細胞遷移

劃痕實驗結(jié)果顯示，空白對照組、DMSO 組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組細胞遷移率分別為（25.43±0.88）%、（24.91±1.72）%、（19.48±1.58）%、（12.57±1.26）%和（6.53±1.32）%，空白對照組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組細胞遷移率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=104.239，P=0.000），5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組細胞遷移率較空白對照組降低（P<0.05），且隨著異丙酚濃度升高，HepG2 細胞遷移率降低，呈現(xiàn)濃度依賴性。DMSO 組細胞遷移率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度異丙酚對HepG2細胞遷移的影響（×100）

2.3 異丙酚抑制HepG2細胞侵襲

Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示，空白對照組、DMSO 組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組穿膜細胞數(shù)分別為（168.20±13.99）個、（162.40±14.15）個、（134.80±7.29）個、（92.00±11.87）個 和（75.00±6.71）個，空白對照組、5 μg/mL 組、10 μg/mL組、20 μg/mL 組穿膜細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=68.277，P=0.000），5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組穿膜細胞數(shù)較空白對照組減少（P<0.05），且隨著異丙酚濃度升高，HepG2 細胞穿膜細胞數(shù)減少，呈現(xiàn)濃度依賴性。DMSO 組穿膜細胞數(shù)與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 不同濃度異丙酚對HepG2細胞侵襲的影響（×100）

2.4 異丙酚對肝癌細胞中MMP-9、VEGF、p-ERK/ERK蛋白表達的影響

Western blotting 結(jié)果顯示，空白對照組、DMSO組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組的MMP-9、VEGF、p-ERK/ERK 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組的MMP-9、VEGF、p-ERK/ERK 的蛋白相對表達量較空白對照組降低（P<0.05）。而DMSO 組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1 和圖4。

圖4 各組細胞中VEGF、MMP-9、p-ERK/ERK蛋白相對表達量

表1 各組細胞中p-ERK/ERK、VEGF、MMP-9蛋白相對表達量比較（）

表1 各組細胞中p-ERK/ERK、VEGF、MMP-9蛋白相對表達量比較（）

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與5 μg/mL 組比較，P<0.05；③與10 μg/mL組比較，P<0.05。

3 討論

肝癌是一種預后不良的侵襲性疾病，其發(fā)病率和病死率都很高，且發(fā)病率仍然呈上升的趨勢。2020 年的全球新發(fā)病例數(shù)約90.6 萬，死亡病例數(shù)約83 萬[10]。盡管生存率變化趨勢有所改善，但肝癌的預后仍然不理想[11]。異丙酚是目前用于外科手術(shù)中最常使用的全身靜脈麻醉藥物之一，在全身麻醉誘導、術(shù)中麻醉維持及重癥監(jiān)護室的輔助鎮(zhèn)靜中被大量使用[12]。近年來，異丙酚的非麻醉作用也已被廣泛研究，比如其抗癌作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類細胞外基質(zhì)降解酶家族，與腫瘤細胞的侵襲關(guān)系十分密切，MMP-9 是該家族中最重要的降解酶之一[13]。VEGF是最強的血管活性因子之一，可使腫瘤周圍血管生成增加，最終促進腫瘤進一步惡化[8]。

研究表明，ERK 信號通路不僅參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展，而且參與了肝癌細胞凋亡、增殖、細胞因子的表達及MMPs 和VEGF 的產(chǎn)生[14]。相關(guān)研究[8-9]顯示，VEGF 和MMP-9 與肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系十分密切，其表達增加可使肝癌細胞周圍的血管生成增加及侵襲能力增強。因此，下調(diào)VEGF、MMP-9 的表達對抑制肝癌的進展變得至關(guān)重要。

大量研究集中于異丙酚對腫瘤細胞的影響。在胃癌細胞中，異丙酚通過上調(diào)miR-195，可以顯著抑制胃癌細胞的進一步惡化[15]。在肺癌細胞中，異丙酚通過調(diào)節(jié)miR-1284 變化從而對肺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移潛能產(chǎn)生抑制作用[16]。在肝癌細胞中，異丙酚可通過下調(diào)miR-374a 從而有效抑制肝癌細胞發(fā)生發(fā)展[17]。本研究通過CCK-8 實驗、Transwell 侵襲實驗及劃痕實驗進一步證明了異丙酚對HepG2 細胞的增殖、侵襲及遷移能力具有抑制作用，與上述研究一致。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，5 μg/mL 組、10 μg/mL 組及20 μg/mL 組細胞增殖率、遷移率降低，穿膜細胞數(shù)減少，且隨著異丙酚濃度升高，HepG2 細胞增殖率、遷移率降低，穿膜細胞數(shù)減少，呈劑量依賴性。這些結(jié)果提示，異丙酚呈劑量依賴性地抑制HepG2 細胞的增殖、侵襲及遷移能力。

據(jù)報道[5]，異丙酚可通過調(diào)控ERK-VEGF/MMP-9 信號通路，對食管癌細胞的活性及轉(zhuǎn)移潛能具有抑制作用[5]。然而，在肝癌中，是否存在ERKVEGF/MMP-9 這樣一條信號通路，且異丙酚是否可通過調(diào)節(jié)該通路抑制肝癌的進展，目前尚不清楚。因此，本研究使用不同濃度的異丙酚處理肝癌細胞，并檢測異丙酚處理細胞后與侵襲、遷移及血管生成相關(guān)蛋白質(zhì)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異丙酚處理的肝癌細胞中VEGF 和MMP-9 蛋白相對表達量降低，表明異丙酚通過下調(diào)MMP-9、VEGF 的表達對肝癌細胞的侵襲及遷移潛能具有抑制作用。

研究表明，異丙酚可通過下調(diào)ERK 信號通路抑制增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1 及MMP-9 的表達，從而抑制乳腺癌細胞的進展[18]。另一項研究報道，異丙酚抑制胰腺癌的生長和轉(zhuǎn)移，可能與下調(diào)ERK/MMPs信號通路有關(guān)[19]。此外，異丙酚一方面通過抑制腫瘤細胞多種促血管生成因子的表達和分泌。另一方面，異丙酚還通過下調(diào)VEGF/VEGFR 通路，產(chǎn)生抗血管生成作用，最終阻止腫瘤進一步惡化，體現(xiàn)了異丙酚的抗癌特性[20]。與上述研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異丙酚處理HepG2 細胞48 h 后，細胞中ERK 總蛋白水平無顯著變化，但p-ERK/ERK 表達下調(diào)，即ERK 磷酸化水平被異丙酚抑制。同時，經(jīng)異丙酚處理后，VEGF 和MMP-9 表達水平降低。提示異丙酚可能通過抑制ERK 發(fā)生磷酸化，從而降低VEGF 和MMP-9 的表達。研究發(fā)現(xiàn)，ERK 信號通路的激活可通過上調(diào)其下游MMP-9 的表達來增加腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而抑制該信號通路可以減少腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[21-22]。此外，先前的研究[23]表明，VEGF 的表達上調(diào)依賴于ERK 的激活，當ERK 信號通路被激活時，可通過上調(diào)VEGF 的表達，從而促進腫瘤血管生成。提示VEGF 是ERK 信號通路的下游。因此，推測丙泊酚可使ERK 信號通路失活，降低ERK 磷酸化水平，從而降低下游靶蛋白VEGF 和MMP-9 的表達，最終抑制肝癌細胞的增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，本研究進一步驗證了異丙酚對肝癌的抗癌活性。異丙酚抑制肝癌細胞株HepG2 的增殖、侵襲及遷移，可能與異丙酚下調(diào)ERK-VEGF/MMP-9 信號通路有關(guān)。但本研究僅在細胞水平驗證異丙酚對肝癌細胞的影響，異丙酚在動物模型上是否存在同樣的信號通路，有待進一步深入研究。