鼻咽癌組織中SP、NK-1R表達與臨床病理特征及預后的關系*

鄧力強，羅德保

（郴州市第一人民醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 郴州 423000）

鼻咽癌是發生于鼻咽部上皮細胞的惡性腫瘤，多發于中國南部和東南亞國家，男性發病率是女性的2～3 倍[1-2]。鼻咽癌發病隱匿，早期癥狀隱蔽，腫瘤惡性程度相對較高[3]。目前臨床常用的治療方案包含放療、化療、外科手術等，雖然一系列醫療措施提升了鼻咽癌患者生存率，但鼻咽癌患者預后仍不理想，治療后復發或轉移仍是造成鼻咽癌患者死亡的主要原因[4]。

癌細胞的復發或轉移是較為復雜的生理病理過程，涉及癌細胞從原發瘤體脫落向周圍組織浸潤、入侵血管、增殖分化等一系列病理過程。P 物質（substance P,SP）是人體內的速激肽之一，可與其受體神經激肽-1（neurokinin-1 receptor,NK-1R）互相作用而發揮多種作用[5-6]。目前國內外研究[7-9]已證實SP、NK-1R 與惡性腫瘤有關，SP、NK-1R 可抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖、分化、遷移及微血管生成，與乳腺癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤細胞的遷移、浸潤關系密切。本研究擬探討鼻咽癌組織中SP、NK-1R 表達與臨床病理特征及預后的關系，期望為鼻咽癌的治療提供新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年4 月—2018 年11 月郴州市第一人民醫院收治的鼻咽癌患者83 例作為研究組，另選取該院同期行鼻中隔偏曲矯正術患者47 例為對照組。其中，研究組男性61 例，女性22 例；年齡（56.23±6.21）歲。對照組男性27 例，女性20 例；年齡（54.94±6.09）歲。兩組的性別構成及年齡比較，差異無統計學意義（χ2=3.533，P=0.060；t=1.146，P=0.254），具有可比性。納入標準：①研究組符合《SEOM 鼻咽癌治療臨床指南2013》[10]的鼻咽癌的診斷標準，對照組經病理證實鼻咽黏膜組織正常；②研究組首次行鼻咽癌根治性治療；③研究組既往未接受任何形式治療；④年齡>18 歲。排除標準：①伴有其他部位惡性腫瘤、嚴重內科合并癥；②重要臟器嚴重功能障礙、血栓高度風險及存在活動性出血；③伴有免疫缺陷性疾病、傳染性疾病、血液系統疾??；④存在溝通障礙；⑤存在治療禁忌證及癌細胞遠處轉移者；⑥無法完成本研究者。本研究經醫院醫學倫理委員會審查批準，患者自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 對照組鼻內鏡輔助下行鼻中隔偏曲矯正術，保留正常鼻咽黏膜組織待檢。參照《SEOM 鼻咽癌治療臨床指南2013》[10]，根據研究組患者個體情況給予根治性放療、化療、外科根治治療等，保留鼻咽癌組織待檢。

1.2.2 研究組鼻咽癌組織、對照組正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R mRNA 相對表達量測定 利用RNA 提取劑RNAiso Plus（日本TaKaRa 公司）提取鼻咽癌組織、正常鼻咽黏膜組織中總RNA，分光光度計測定總RNA 濃度、純度，篩選后利用逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）逆轉錄成cDNA，以cDNA 為模板行PCR 擴增，之后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）（美國ABI 7500 Fast Realtime PCR System PCR 儀）。反應體系為20 μL：基組DNA 1 μL、正反向引物各0.5 μL、PCR 緩沖液10 μL、蒸餾水8 μL。反應程序：95℃預變性2 min，95℃變性12 s，60℃退火32 s，72℃延伸3 min，共38 個循環。GAPDH為內參基因，以Ct 值為基礎，2-ΔΔCt法計算鼻咽癌組織、正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R mRNA 相對表達量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3 免疫組織化學法檢測研究組鼻咽癌組織和對照組正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R 蛋白的表達 鼻咽癌組織和正常鼻咽黏膜組織標本多聚甲醛固定、脫水，石蠟包埋、切片，滅活、微波抗原修復、洗滌，添加兔抗人SP、NK-1R 抗體，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加生物素標記山羊抗兔二抗后，室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗，二氨基聯苯顯色后，蘇木精復染、脫水、封片。染色程度為無色（0 分）、淡棕色（1 分）、棕色（2 分）、棕褐色（3 分）；染色范圍<5%為0 分、5%～<25%為1 分、25%～<75%為2 分、≥75%為3 分；計算染色程度與染色范圍評分的乘積，0 分者為陰性表達，否則為陽性表達。

1.2.4 隨訪 研究組患者治療后以門診復查、住院治療、電話等方式隨訪3 年，1 次/月。參照《鼻咽癌復發、轉移診斷專家共識》[11]判斷隨訪期間復發或轉移情況，出現復發或轉移則終止隨訪。無病生存是指隨訪期間無復發或轉移情況出現。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較采用t檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較做χ2檢驗；用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較采用Log rank χ2檢驗；影響因素的分析采用多因素Cox 比例風險模型。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組SP、NK-1R mRNA相對表達量比較

研究組鼻咽癌組織與對照組正常鼻咽黏膜組織中的SP、NK-1R mRNA 相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P<0.05），鼻咽癌組織中SP、NK-1R mRNA 相對表達量高于正常鼻咽黏膜組織。見圖1 和表2。

表2 兩組SP、NK-1R mRNA相對表達量比較（）

表2 兩組SP、NK-1R mRNA相對表達量比較（）

圖1 研究組鼻咽癌組織與對照組正常鼻咽黏膜組織中的SP、NK-1R mRNA表達

2.2 研究組鼻咽癌組織和對照組正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R蛋白的表達

研究組鼻咽癌組織和對照組正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R 蛋白的表達見圖2。研究組鼻咽癌組織與對照組正常鼻咽黏膜組織中的SP、NK-1R 蛋白陽性表達率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P<0.05），鼻咽癌組織中SP、NK-1R 蛋白陽性表達率高于正常鼻咽黏膜組織。見表3。

圖2 研究組鼻咽癌組織和對照組正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R蛋白的表達（IHC×200）

表3 鼻咽癌組織和正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R蛋白陽性表達率的比較 例（%）

2.3 研究組不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織中SP、NK-1R蛋白陽性表達率的比較

不同性別、年齡、N 分期的研究組患者鼻咽癌組織中SP、NK-1R 陽性表達率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。不同T 分期、M 分期、臨床分期的研究組患者鼻咽癌組織中SP 陽性表達率比較，差異有統計學意義（P<0.05）；研究組T3、T4期患者的鼻咽癌組織中SP 陽性表達率高于T1、T2期患者，研究組M1期患者的鼻咽癌組織中SP 陽性表達率高于M0期患者，Ⅲ～Ⅳa 期的研究組患者鼻咽癌組織中SP 陽性表達率分別高于Ⅰ、Ⅱ期患者。不同M 分期、臨床分期的研究組患者鼻咽癌組織中NK-1R 陽性表達率比較，差異有統計學意義（P<0.05）；研究組M1期患者的鼻咽癌組織中NK-1R 陽性表達率高于M0期患者，研究組Ⅲ～Ⅳa 期患者的鼻咽癌組織中NK-1R 陽性表達率分別高于Ⅰ、Ⅱ期患者。見表4。

表4 研究組不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織中SP、NK-1R蛋白陽性表達率的比較 例（%）

2.4 影響鼻咽癌患者治療后復發或轉移的因素

83 例鼻咽癌患者截至隨訪結束時失訪8 例（7 例為SP 蛋白陽性表達，1 例為SP 陰性表達；8 例均為NK-1R 蛋白陽性表達）。75 例鼻咽癌患者中10 例（13.33%）出現復發或轉移。

單因素分析顯示，T 分期、M 分期、臨床分期、SP陽性、NK-1R 陽性是影響鼻咽癌患者治療后復發或轉移的因素（P<0.05）。見表5。

表5 影響鼻咽癌患者治療后復發或轉移的單因素分析

以鼻咽癌患者治療后復發或轉移為因變量（未復發或轉移=0，復發或轉移=1），以T 分期（T1、T2=0，T3、T4=1）、M 分期（M0=0，M1=1）、臨床分期（Ⅰ、Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳa=1）、SP 陽性（SP 陰性=0，SP 陽性=1）、NK-1R陽性（NK-1R陰性=0，NK-1R陽性=1）為自變量，納入多因素Cox 比例風險模型，α入=0.05、α出=0.10，結果顯示：M 分 期[R^R=4.958（95% CI：2.040，12.050）]、臨床分 期[R^R=6.593（95% CI：2.713，16.023）]、SP 陽性[R^R=4.063（95% CI：1.672，9.875）]、NK-1R 陽 性[R^R=4.047（95% CI：1.665，9.836）]是影響鼻咽癌患者治療后復發或轉移的獨立危險因素（P<0.05）。見表6。

表6 影響鼻咽癌患者治療后復發或轉移的Cox多因素分析

2.5 研究組患者鼻咽癌組織中SP、NK-1R蛋白表達與治療后復發轉移的關系

隨訪3 年，43 例SP 陽性表達患者無病生存34 例，生存率為80.64%；32 例SP 陰性表達患者無病生存31 例，生存率為96.87%；SP 陰性表達與陽性表達患者的生存率比較，經Log rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=4.453，P=0.035），SP 陰性表達患者的生存率高于陽性表達患者。見圖3。

圖3 鼻咽癌組織中SP陰性、陽性表達患者的生存曲線圖

隨訪3 年，38 例NK-1R 陽性表達患者無病生存29 例，生存率為78.21%；37 例NK-1R 陰性表達患者無病生存36 例，生存率為97.32%；NK-1R 陽性表達患者與陰性表達患者的生存率比較，經Log rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=6.451，P=0.011），NK-1R 陰性表達患者的生存率高于陽性表達患者。見圖4。

圖4 鼻咽癌組織中NK-1R陰性、陽性表達患者的生存曲線圖

3 討論

鼻咽癌屬于頭頸部惡性腫瘤之一，其發生可能與愛潑斯坦-巴爾病毒感染、遺傳、生活環境等多種因素相關[12]。目前國內外已有報道指出SP、NK-1R 在乳腺癌[7]、甲狀腺癌[8]等多種癌癥中異常高表達。但是目前關于鼻咽癌組織中SP、NK-1R表達特征尚缺乏報道，鼻咽癌組織中SP、NK-1R的表達與患者臨床病理特征及預后的關系仍缺乏數據支持。

本研究顯示鼻咽癌組織中SP、NK-1R mRNA相對表達量均高于正常鼻咽黏膜組織，鼻咽癌組織中SP、NK-1R 蛋白陽性表達率均高于正常鼻咽黏膜組織，說明SP、NK-1R 在鼻咽癌患者癌組織中異常高表達。M1期、Ⅲ～Ⅳa 期的鼻咽癌患者癌組織中SP、NK-1 蛋白陽性表達率分別高于M0期、Ⅰ、Ⅱ期者，T3、T4期的鼻咽癌患者癌組織中SP陽性表達率高于T1、T2期者，提示SP、NK-1R 不僅與鼻咽癌發生有關，且與鼻咽癌患者病情相關的病理特征也有關，SP、NK-1R 可能與鼻咽癌患者預后關系密切。Cox 回歸分析顯示M 分期、臨床分期、SP 陽性、NK-1R 陽性是影響鼻咽癌患者治療后復發或轉移的危險因素，說明并印證鼻咽癌患者癌組織中SP、NK-1R 的表達是影響鼻咽癌患者預后的因素。SP 作為一種速激肽，可與其受體NK-1R 互相作用發揮多途徑生物學功效，SP 與NK-1R 系統能夠偶聯激活磷脂酶C 及腺苷酸環化酶，合成肌醇三磷酸、二酰甘油、環腺苷磷酸，參與離子通道活性，傳導信號至絲裂原活化蛋白激酶，蛋白激酶激活細胞外的細胞外調節蛋白激酶1/2，進而促進惡性腫瘤細胞有絲分裂、合成DNA，促進鼻咽癌細胞增殖、分化、侵襲和轉移。GONZáLEZ-MOLES 等[13]研究指出SP、NK-1R 系統可啟動、激活惡性腫瘤發生、發展等生理病理過程的信號通路。SINGH 等[14]研究顯示SP 與NK-1R系統可促使抗凋亡因子Akt 信號激活，從而抑制Fas 配體等凋亡因子對腫瘤細胞的影響。張渝等[15]研究指出SP 可誘導鼻咽癌HNE1 細胞增殖、侵襲。

本研究顯示，SP 陰性表達的鼻咽癌患者的生存率高于SP 陽性表達者，NK-1R 陰性表達的鼻咽癌患者的生存率也高于NK-1R 陽性表達者，再次印證鼻咽癌患者癌組織SP 及NK-1R 表達與其預后有關。既往研究也指出SP 及NK-1R 在其他惡性腫瘤中的相似作用，JAVID 等[16]報道SP、NK-1R 陽性表達的食管鱗狀細胞癌患者的生存期明顯短于SP、NK-1R 陰性表達者；AFSHARI 等[17]研究顯示SP、NK-1R 陽性表達的結直腸癌患者預后不良的風險更高；周云麗等[18]研究指出SP、NK-1R 表達上調與乳腺癌患者癌細胞浸潤、轉移呈正相關，與乳腺癌患者預后不良關系緊密。

綜上所述，鼻咽癌患者癌組織中SP、NK-1R表達與臨床病理特征及預后有關，SP、NK-1R 陽性表達患者治療后復發轉移風險高。本研究樣本量較小，隨訪時間有限，后期將針對不足之處開展多心中、大樣本量研究，并延長隨訪時間進一步佐證本研究結論，并著重分析SP、NK-1R 通路對鼻咽癌細胞增殖、分化、遷移的影響，更深入了解SP、NK-1R 在鼻咽癌中的作用機制。