錯配修復基因在乙型肝炎病毒相關肝細胞癌中表達的影響因素

高玉雪 寧琪琪 蔡玉瑩 關媛月 楊鵬翔 陳德喜

首都醫科大學附屬北京佑安醫院北京肝病研究所，北京 100069

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，是原發性肝癌的一大類，惡性程度高，浸潤性強[1-3]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是引發HCC 最常見和最主要的原因[4-6]。手術切除是目前治療HCC 患者的最佳治療手段。嗜肝病毒科的特征之一是病毒DNA 整合到宿主染色體，整合的HBV DNA 誘導染色體不穩定性，基因不穩定性是HCC 發生的重要原因之一[6-7]。目前錯配修復基因（mismatch repair gene，MMR）的研究主要集中在結直腸癌領域[8-10]，對其在HCC 中的表達情況研究較少。本研究旨在探討MMR 在HBV 相關HCC 中的表達情況及其影響因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年12 月至2021 年6 月首都醫科大學附屬北京佑安醫院（以下簡稱“我院”）收治的125 例HBV相關HCC 患者，根據病理標本行免疫組化檢查MMR表達，其中男108 例，女17 例；年齡29～80 歲，平均（53.58±10.24）歲。按照MutL 蛋白同系物1（MutL homologue 1，MLH1）、MutS 蛋白同系物2（MutS homologue 2，MSH2）、MutS 蛋白同系物6（MutS homologue 6，MSH6）和減數分裂后分離蛋白2（postmeiotic segregation increased 2，PMS2）基因表達缺失情況，分為MMR 缺失（deficiencyMMR，dMMR）組18 例，MMR 正常（proficiency MMR，pMMR）組（107 例）。納入標準：①符合《原發性肝癌診療規范（2019 年版）》[11]中HCC 的診斷標準；②HBV 感染；③手術切除原發病灶；④MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2 免疫組化結果完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤或既往惡性腫瘤史；②合并其他病毒感染。本研究經我院醫學倫理委員會審批（京佑科倫字[2021]080 號）。

1.2 研究方法

收集患者的臨床病理資料，包括性別、年齡、谷草轉氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）、異常凝血酶原、甲胎蛋白、谷丙轉氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、總膽紅素、直接膽紅素、白蛋白和球蛋白、腫瘤分化程度、Edmondson 分級、壞死情況、衛星結節、微血管侵犯、增殖細胞核抗原指數（Ki-67 labeling index，Ki-67）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC-3）、肝細胞石蠟抗原1（hepatocyte paraffin-1，HepPar-1）、P53 蛋白、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）、乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）表達情況。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 或GraphPad Prism 9.0.0 軟件對所得數據進行統計學分析。正態分布的計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；偏態分布的計量資料采用中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示，比較采用Mann-Whitney U 檢驗。計數資料采用例數或百分率表示，比較采用χ2檢驗。等級資料比較采用秩和檢驗。采用logistic 回歸模型分析影響因素。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 dMMR 組基因缺失情況

dMMR 組缺失情況包括MLH1/PMS2 表達缺失者4 例，MLH1 表達缺失者1 例，MSH2/PMS2 表達缺失者1 例，PMS2 表達缺失者12 例。

2.2 兩組病理特征比較

dMMR 組壞死率、微血管侵犯率低于pMMR 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。兩組分化程度、Edmondson 分級、P53 蛋白強度比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 兩組病理特征比較（例）

2.3 兩組臨床指標比較

dMMR 組GOT、異常凝血酶原水平低于pMMR 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 兩組臨床指標比較[M（P25，P75）]

2.4 HBV 相關HCC 患者發生dMMR 的影響因素分析

以MMR 表達情況為因變量（dMMR=1，pMMR=0），以壞死情況（有=1，無=0）、微血管侵犯情況（有=1，無=0）、分化程度（中及中低分化、低分化=1，高及高中分化=0）、Edmondson 分級（Ⅲ級、＞Ⅲ級=1，≤Ⅱ級、Ⅱ～Ⅲ級=0）、P53（陽性=1，陰性=0）、GOT、異常凝血酶原為自變量進行多因素分析，結果顯示，Edmondson分級、GOT 水平是dMMR 發生的獨立影響因素（P ＜0.05）。見表3。

表3 HBV 相關HCC 患者發生dMMR 的影響因素分析

3 討論

HCC 是消化系統常見的惡性腫瘤，可由基因遺傳因素和環境因素共同作用引起，基因組不穩定性是其發生發展的原因之一[3,12]。DNA 錯配修復可識別并修復DNA 合成過程中產生的堿基錯配，維持基因組穩定，保證遺傳信息準確性，MMR 功能缺陷可引起微衛星不穩定性[13-15]。MMR 主要包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，以MLH1 和MSH2 主導的蛋白質二聚體，分別與PMS2 蛋白質和MSH6 蛋白質形成異源二聚體[16-17]。

HCC 患者中存在MLH1、MSH2、PMS2 和p16 的啟動子甲基化，且其啟動子沉默在晚期HCC 中更容易被檢測到[18]。在丙型肝炎病毒相關HCC 中，MSH2 或MLH1 低表達與腫瘤低分化關系密切，與其他臨床病理指標無關[19]。HCC 中DNA 損傷修復體細胞突變者具有更高的腫瘤突變負荷，也具有更高的基因突變，如MLH1、MSH2、細胞周期檢驗點激酶2 等[20]。最近研究顯示，MSH2（rs2303428）與HBV 感染和家族史相互作用，增加HCC 發生風險，多因素分析顯示rs2303428、腫瘤數量、腫瘤分期、轉移對HCC 患者預后有顯著影響[21]。

本研究發現，HBV 相關HCC 中dMMR 發生率為14.4%（18/125），提示MMR 缺失在HCC 中可能是低頻事件。與Wang 等[22]研究結果一致，在36 例HCC患者中免疫組織化學結果顯示均檢測到hMLH1 和hMSH2 表達，提示不存在hMLH1 和hMSH2 失活突變或hMLH1 啟動子高甲基化。但張翠娟等[23]研究發現，在HCC 患者中hMLH1 和hMSH2 基因啟動子CpG 島的甲基化較為常見，其中hMSH2 基因啟動子甲基化是誘導HCC發生發展的早期事件。MMR 表達的減少在丙型肝炎病毒相關HCC 中起著重要的作用，hPMS2 可能參與HCC 發生的早期階段，其表達降低可能為HCC提供生長優勢[24]。不同于dMMR 的結腸癌獨特的病理學特征[25]，本研究顯示，HBV 相關HCC 患者dMMR 也有獨特的病理學特征，微血管侵犯發生率較低，Edmondson分級較低，組織學分化較好，壞死較少，低p53 表達，低GOT 和異常凝血酶原，其dMMR發生情況與Edmondson 分級較低、GOT 水平有關。本研究存在一些局限，如入選患者人數有限，需要加大樣本研究；缺乏長期隨訪結果，不能明確MMR 蛋白表達缺失與治療及預后的關系。綜上所述，dMMR 在HBV 相關HCC 中是一種低頻事件，但是其可能是一種有效的靶標，具體調控機制及與HBV 相關HCC 發生發展的關系，尚需進一步研究探討。