血必凈注射液對體外循環(huán)后急性肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡相關微RNA 表達的影響

徐朝軍 張勝康 張 怡 周代勇 宋 嵐

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心胸外科，湖南長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學生物化學與分子生物學教研室，湖南長沙 410208

隨著體外循環(huán)方法和外科技術的提高，體外循環(huán)心臟手術的安全性大大提高，然而肺部并發(fā)癥是心臟術后重要的死亡原因，而大多數(shù)肺部并發(fā)癥與體外循環(huán)術后急性肺損傷有關[1-2]，微RNA（miRNA）是一類內源性的非編碼RNA 分子，它們在轉錄后水平沉默特定基因，對生物體基因表達發(fā)揮精細調節(jié)的作用。研究發(fā)現(xiàn)microRNA 可能在體外循環(huán)急性肺損傷中也發(fā)揮重要作用[3-4]。

血必凈注射液臨床廣泛用于膿毒癥及急性肺損傷[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，血必凈可以有效改善體外循環(huán)術后患者的肺功能，但是其具體機制目前尚未明確[7-9]。近年來研究表明，中藥及其活性成分對miRNA 能起到廣泛調節(jié)作用[10-11]，本研究運用生物信息學技術獲取與肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡相關性的候選miRNAs，再建立SD 大鼠體外循環(huán)肺損傷模型，通過real-time PCR 的方法觀察血必凈對體外循環(huán)急性肺損傷肺泡Ⅱ型上皮細胞中候選miRNA 表達的影響，從分子水平探討血必凈注射液治療體外循環(huán)急性肺損的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 30 只清潔級雄性SD 大鼠購于湖南中醫(yī)藥大學動物中心，動物使用許可證號：SYXK（湘）2013-0005（動物合格證號：43004700020981），20～22 周齡，體重450～500 g。所有動物實驗均獲得湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會許可并按照國際實驗動物護理和使用指南進行（ZYFY20171017）。

1.1.2 實驗藥品 血必凈注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號：Z20040033）；戊巴比妥鈉（sigma 公司）。

1.1.3 實驗試劑 DMEM 培養(yǎng)基、Trizol、cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號：11752250，Invitrogen 公司）；無支原體小牛血清（杭州四季青生物工程公司）；10%水合氯（青島育龍化學試劑有限公司）；彈性蛋白酶（Becton-Dickinson 公司）；胰脫氧核糖核酸酶（Sigma 公司）；鼠IgG（Becton-Dickinson 公司）；TaqManTMmicroRNA 分析試劑盒（貨號：4366596，Biosystems 公司）；PCR 引物由上海英駿公司合成；miRcute miRNA 提取分離試劑盒（貨號：CW0627，北京康為世紀生物科技有限公司）；miRNA 熒光定量檢測試劑盒（貨號：CW2142，北京康為世紀生物科技有限公司）。

1.1.4 實驗儀器 熒光定量PCR 儀（LC-480Ⅱ型，美國Perkin-Elmer 公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（賀利氏HERAcell 150 i，賽默飛世爾公司）；超凈工作臺（CJ-1B 北京半導體設備廠）；倒置相差顯微鏡（CKX31，日本Olympus 公司）；-80℃低溫冰箱（Forma 995，美國FORMA 公司）；可見紫外分光光度計（UV-2600i，日本島津公司）。

1.1.5 相關數(shù)據(jù)庫的使用及靶基因預測工具 大鼠miRNA 數(shù)據(jù)庫：miRBase（http：//www.mirbase.org/cgi-bin/querv.pl?terms=rat）；mRNAMap（http：//mimamap.mbc.nctu.edu.tw/html/search.html）；miRDB（http：// www.mirdb.org/cgi-bin/search.egi）。

miRNA 靶基因預測軟件：MirTarget（http：//llmirdb.org/miRDB/policy.htral）；TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert 50/）；Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）。

1.2 研究方法

1.2.1 篩選大鼠miRNAs 利用miRBase 數(shù)據(jù)庫、mRNAMap 數(shù)據(jù)庫及miRDB 數(shù)據(jù)庫，以“rat”為關鍵詞搜索，獲得的各數(shù)據(jù)庫的大鼠miRNAs，然后整合去掉重復miRNAs 信息。

通過MirTarget 和TargetScan 軟件，篩選出與大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡相關的靶基因及其對應的miRNA。

獲得候選miRNAs，采用DAVID 軟件，分析上述靶基因預測工具獲得的miRNAs 靶基因的功能，以“肺泡Ⅱ型上皮細胞”“凋亡”“肺臟”為關鍵詞篩選，從其中找出與大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡相關的靶基因（score＞95），并得到對應的miRNAs。

1.2.2 動物分組及體外循環(huán)所致急性肺損傷大鼠模型制備 按隨機數(shù)字表法將30 只大鼠分為三組：假手術組、體外循環(huán)組、血必凈組，每組10 只。假手術組于血管穿刺前2 h、體外循環(huán)組于體外循環(huán)前2 h 經腹腔注射4 ml/kg 的生理鹽水。血必凈組在麻醉后體外循環(huán)前2 h 經腹腔注射血必凈注射液4 ml/kg。實驗前大鼠自由飲水但禁食6 h。采用腹腔內注射麻醉（2%戊巴比妥按50 mg/kg），根據(jù)術中情況予靜脈追加戊巴比妥以維持麻醉。采用頸部氣管切開后行氣管內插管并縫合固定，予以小動物呼吸機行機械通氣。在將溫度探頭置入大鼠直腸內監(jiān)測溫度并采用變溫毯調節(jié)體溫，經股動脈置管監(jiān)測有創(chuàng)血壓，肢體導聯(lián)連接心電監(jiān)護儀進行監(jiān)測。假手術組不建立體外循環(huán)，體外循環(huán)組和血必凈組參照文獻[10]方法建立大鼠體外循環(huán)模型并進行體外循環(huán)管理，用20G 套管穿刺尾動脈并與小動物膜肺的動脈血出口連接，采用多孔16G 套管針穿刺右側頸外靜脈并置管于右心房處，引流靜脈血入儲血槽，采用動物特制膜肺進行氧合，由轉流泵驅動體外循環(huán)。轉流開始時灌注量約40 ml/（kg·min），循環(huán)流量逐步增加至100 ml/（kg·min），保持該流量并維持此轉速1 h 后逐步降低流量直到停止體外循環(huán)，術中密切監(jiān)測心率、血壓、體溫等指標，體外循環(huán)結束后先拔除靜脈插管，以低流量灌注將機器管路里的血液經尾動脈回輸動物體內，在血壓穩(wěn)定后拔除插管，繼續(xù)監(jiān)測有創(chuàng)血壓2 h，嚴密觀測大鼠生命體征，麻醉蘇醒，放入鼠籠，繼續(xù)禁食不禁飲。假手術組僅行動、靜脈穿刺置管不行體外循環(huán)，其他處理同體外循環(huán)組。

1.2.3 大鼠肺濕/干重比（wet to dry weight ratio，W/D）和大鼠肺泡損傷數(shù)定量評價指標（index of quantitative assessment，IQA）的測定 體外循環(huán)結束后4 h 放血處死大鼠，取左肺下葉，生理鹽水反復清洗，濾紙去除多余水分并立即稱重，即為濕重（wet，W）；然后將這些樣品真空干燥直到重量恒定再予以稱重，即為干重（dry，D），計算W/D。取左上肺組織，經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。測定肺泡IQA。

1.2.4 SD 大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞分離及培養(yǎng)SD 大鼠制備體外循環(huán)肺損傷模型后進行肺泡Ⅱ型上皮細胞分離。SD 大鼠進行腹腔注射麻醉，胸主動脈放血法處死大鼠。經肺動脈和支氣管反復灌注PBS（8 次，10 ml/次），以減少肺組織中的中性粒細胞。剪取適量肺組織置于37℃水中水浴20 min，再經支氣管導管向氣管內緩慢注入含172 U 彈性蛋白酶的40 ml PBS。仔細修剪與肺組織相連的其他組織和心臟組織，將1 000 U DNAse I 加入肺組織中，再用顯微剪將肺組織反復剪碎，加入5 ml 低IgG 的胎牛血清滅活DNAseI。在室溫條件下輕柔地攪拌20 min，先后采用孔徑為500、200、105 μm 的聚酯篩網(wǎng)過濾，然后重懸于30 ml DMEM中，予以450 g 離心10 min，緊接著再將細胞重懸于45 ml DMEM 中。然后將收集細胞接種至事先包被鼠IgG（30 μg/ml）的100 mm 培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)1 h，以去除剩余的中性粒細胞。采用DMEM多次洗滌培養(yǎng)皿并收集肺泡Ⅱ型上皮細胞。再次離心后將肺泡Ⅱ型上皮細胞重懸于10～20 ml DMEM（含10%小牛血清，1%慶大霉素，1%青霉素，1%非必需氨基酸，1%L-谷氨酸）中。先行細胞計數(shù)，并測定細胞活力（臺盼藍染色）。選取檢測活性＞95%的細胞接種至8 孔培養(yǎng)板中（1×106/ml，0.5 ml/孔）。置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)48 h，收集貼壁細胞并得到肺泡Ⅱ型上皮細胞，再將細胞繼續(xù)培養(yǎng)于含10%小牛血清，2%慶大霉素，2%青霉素，2%非必需氨基酸，2%L-谷氨酸的DMEM 中，用于后續(xù)實驗。

1.2.5 RFPCR 檢測microRNA 表達 用miRNA 提取試劑盒提取細胞樣本中miRNA。使用TaqMan microRNA reverse transcription 試劑盒逆轉錄micorRNA生成cDNA，逆轉錄體系和條件參考說明書[反應體系：Poly（A）反應液4 μl，dNTP（10 mmol/L）1 μl，25 μmol/L RT 引物3 μl，5×RT 緩沖液4 μl，逆轉錄酶0.5 μl，無RNA 酶水7.5 μl]。qRT-PCR 反應體系參照試劑盒說明書進行[反應體系：2×miRNA qRT-PCR 預混液10 μl，上游引物（10 μmol/L）0.4 μl，下游引物（10 μmol/L）0.4 μl，模板2 μl，加入滅菌蒸餾水至20 μl]。rno-miR-17-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-CAAAGUGCUUACAGUGC-3’；rno-miR-34a-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UGGC AGUGUCUUAGCU-3’；rno-miR-26a-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UUCAAGUAAUCCAGGA-3’；rno-miR-21-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UAGCUUAUCAGACUGA-3’；rno-miR-375-3p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UUUGUUCGUUCGGCUC-3’；采用U6 RNA 作為內參，正向引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-△△ct法計算miRNA 的表達變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠miRNA 列表信息

通過數(shù)據(jù)庫搜索、整合得到495 個大鼠miRNA。利用MirTarget 等靶基因在線預測軟件預測到大鼠438 個miRNA 的靶標基因1 932 個（Score＞99.0）。未預測到的其他57 個miRNAs，一部分miRNA 沒有搜索到靶基因，還有一部分miRNA 與438 條miRNA 中部分miRNA 具有高度相似結構。對miRNA 分子進行功能注釋及分析，獲取與肺泡Ⅱ型上皮細胞、細胞凋亡以及在肺臟表達相關的miRNA。然后通過DAVID工具對miRNA 靶基因分析，并將功能分析結合文獻調研等方法，確定rno-miR-17-5p、rno-miR-34a-5p、rno-miR-26a-5p、rno-miR-21a-5p 和rno-miR-375-3p 這五條miRNA 與肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡相關。

2.2 三組大鼠肺組織W/D、IQAI 比較

體外循環(huán)組W/D 和IQA 高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。血必凈組W/D、IQA 低于體外循環(huán)組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 三組大鼠肺組織W/D、IQA 比較（）

表1 三組大鼠肺組織W/D、IQA 比較（）

注 與假手術組比較，aP ＜0.05；與體外循環(huán)組比較，bP ＜0.05。W/D：濕/干重比；IQA：肺泡損傷數(shù)定量評價指標

2.3 血必凈對體外循環(huán)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞miRNA表達的影響

體外循環(huán)組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞rno-miR-17-5p 表達較假手術組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；而血必凈組rno-miR-17-5p 高于體外循環(huán)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而體外循環(huán)組rno-miR-34a-5p 表達高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；但是rno-miR-34a-5p 在體外循環(huán)組及血必凈組差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。其余候選miRNAs的表達在假手術組、體外循環(huán)組及血必凈組差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 血必凈對體外循環(huán)肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞microRNA 表達的影響

3 討論

體外循環(huán)是心臟直視手術的必要手段。盡管有先進的器官保護技術和術后嚴密監(jiān)測，但體外循環(huán)術后的器官功能不全仍時有發(fā)生，而體外循環(huán)術后急性肺損傷是體外循環(huán)術后最常見的并發(fā)癥之一[1]。

大量研究顯示，在體外循環(huán)肺損傷中有復雜的細胞凋亡發(fā)生，其中由各種凋亡相關基因異常表達所致的肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡在體外循環(huán)肺損傷發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，減輕肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡過度激活，可能是防治體外循環(huán)肺損傷的重要策略之一[12-13]。本研究采用生物信息學篩選了可能與肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡相關的miRNA。通過整合幾種常用數(shù)據(jù)庫中包含的大鼠miRNA 信息，然后進一步采用靶基因預測軟件獲得了候選miRNA 靶基因序列并分析候選基因的功能，篩選得到與肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡相關的miRNAs 5 條：rno-miR-17-5p、rno-miR-34a-5p、rno-miR-26a-5p、rno-miR-21a-5p 和rno-miR-375-3p。

現(xiàn)代藥理學研究證實，血必凈注射液可通過多種機制對急性肺損傷起保護作用[14-17]。本研究結果顯示，與假手術組比較，體外循環(huán)組大鼠肺組織W/D 及QIA 升高，提示大鼠體外循環(huán)所致急性肺損傷模型制備成功。而血必凈組W/D 及QIA 較體外循環(huán)組降低，表明經血必凈注射液處理可以減輕體外循環(huán)誘導的急性肺損傷，血必凈注射液可能是體外循環(huán)誘導的急性肺損傷的潛在治療藥物。

體外循環(huán)急性肺損傷歸屬于中醫(yī)“暴喘”“喘脫”的范疇。研究已表明，體外循環(huán)肺損傷的基本病機為外邪犯肺、病位在肺腎，病機關鍵在于“熱、瘀、水（濕）、虛”4 個方面[18-20]。而血必凈注射液源于血府逐瘀湯，具有活血化瘀、清熱解毒等功效。其功效與體外循環(huán)急性肺損傷的發(fā)生及中醫(yī)防治機制的認識相吻合。然而血必凈治療體外循環(huán)急性肺損的機制尚不明確，還需要深入探索和研究。文獻報道，血必凈的有效成分可以調節(jié)不同細胞miRNA 表達[21]。因此本研究進一步檢測血必凈對體外循環(huán)肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡相關候選miRNA 表達的影響。

本研究結果發(fā)現(xiàn)：體外循環(huán)組肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞miR-17-5p 表達較假手術組下降，而miR-34a-5p 表達上調，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；血必凈組miR-17-5p 較體外循環(huán)則組顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；但是miR-34a-5p 在體外循環(huán)組及血必凈組差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。研究顯示，miR-17-5p 在胚胎肺上皮祖細胞中高表達，而且可以通過調節(jié)細胞周期調節(jié)基因Rbl2 表達調節(jié)肺上皮細胞分化和增殖[22]。研究還顯示，miR-17-5p對肺血管內皮細胞及多種腫瘤細胞凋亡有調節(jié)作用[23-25]，本研究也顯示，體外循環(huán)肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞miR-17-5p 表達顯著下降，而血必凈組肺泡Ⅱ型上皮細胞miR-17-5p 表達較體外循環(huán)組顯著上升。本研究推測血必凈可以通過上調肺泡Ⅱ型上皮細胞miR-17-5p 表達抑制肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡，這可能是血必凈治療體外循環(huán)后急性肺損傷的機制之一。

但是血必凈通過調控肺泡Ⅱ型上皮細胞miR-17-5p 表達抑制細胞凋亡發(fā)揮治療體外循環(huán)急性肺損作用的靶點及機制尚需在后續(xù)工作中深入探索和研究。