骨髓間充質干細胞對K562 細胞衰老的作用及Raf/ MEK/ ERK 信號通路的影響

周 雯 周 玥 唐紫云 何思悅 劉小虎 畢子瑩 李敏瑞 楊 楠

大理大學組織學與胚胎學教研室，云南大理 671000

慢性髓系白血病是一種未成熟髓細胞在體內大量擴增的增生性疾病。酪氨酸激酶抑制劑作為一線治療，提高了患者的生存率[1-3]，但耐藥、不良反應及高成本，使其應用受到限制[4-6]。骨髓微環境是造血干細胞生長發育的主要場所，與白血病的發生有著密切的聯系[7-10]。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作為微環境中的基質細胞對白血病的進展起到了一定的調控作用[11-12]。K562 細胞與間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）進行直接或間接共培養后，其增殖均受到抑制，但間接培養中的抗增殖作用較弱，表明細胞間直接接觸的重要性[13]。誘導腫瘤細胞衰老是腫瘤治療的新策略[14-17]，可以為患者提供等效或更長的生存期。但目前報道的BMSCs通過誘導K562 細胞衰老而抑制白血病進展的研究少見，本研究主要探究BMSCs 能否誘導K562 衰老及其可能的機制，為白血病的治療提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8 周SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠30 只，體重20～30 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號為430727210100922464，許可證號為SCXK（湘）2019-0004，本實驗由大理大學動物倫理委員會批準（2020-028）。實驗動物飼養環境溫度為22～25℃，濕度45%～55%，提供充足的水和飼料，飼養1 周后進行實驗。

1.2 主要試劑及器材

DMEM/F12 培養基（Gibco 公司，8120254）；成脂、成骨分化誘導培養基（Cyagen 公司，MUBMX-90031、MUBMX-90021）；SA-β-Gal 衰老染色試劑盒（碧云天生物技術有限公司，C0602）；流式細胞儀（Beckman，美國Cyto-FLEX）。CD29、CD44、CD45（Bioscience 公司，美國SC3746、SC7297、SC1178）；CDKN2A/p16INK4a、β-actin、HRP 標記山羊抗兔IgG（abcam，英國，EPR1473、ab210083、ab97051）；GAPDH、兔抗人多克隆抗體p-Raf、p-MEK、p-ERK（Santacruze，美國，sc-47724、sc-135707、sc-101733、sc-101760）。K562 細胞購自齊氏生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 BMSCs 的培養和鑒定 取小鼠雙下肢骨髓細胞，使用DMED/F12 完全培養基重懸細胞，轉入6 cm 塑料培養皿中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。取第3 代BMSCs 的細胞懸液，采用流式細胞術檢測BMSCs表面抗原CD29、CD244、CD45 的表達。使用成脂、成骨分化誘導液誘導后，采用油紅O、茜素紅染色鑒定BMSCs 的分化能力。

1.3.2 CCK-8 法檢測細胞增殖情況 取第3 代BMSCs，將0、0.25×105、0.5×105、1×105、2×105個BMSCs 分別鋪入3 個24 孔板，每個濃度設置3 個復孔，置于37℃，5%CO2培養箱中培養12 h，貼壁后每孔加入1×105個K562 細胞懸液500 μl，即BMSCs 與K562細胞的比例為1∶4、1∶2、1∶1、2∶1，未添加BMSCs 的K562 細胞作為對照。于24、48、72 h 收集細胞鋪入96 孔板中，每孔100 μl，檢測450 nm 處吸光度值并計算K562 細胞增殖率。選擇K562 細胞增殖率最低時的共培養時間及細胞比例作為BMSCs 組，常規培養的K562 細胞作為對照組進行后續實驗。

1.3.3 SA-β-Gal 染色法檢測細胞衰老情況 兩組細胞進行衰老染色，顯微鏡下觀察并計算400 個細胞中的衰老陽性細胞率。本實驗重復3 次。

1.3.4 Western blot 檢測p16INK4a、p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白的表達量 收集兩組細胞提取并測定總蛋白濃度，電泳、轉膜、封閉后，加入兔抗鼠CDKN2A/p16INK4a（1∶1 000）、內參一抗β-actin（1∶1 000）。p-Raf（1∶5 000）、p-MEK（1∶20 000）、p-ERK（1∶10 000）和內參一抗GAPDH（1∶1 000）4℃過夜，TBST 緩沖液漂洗2 次，加入二抗HRP 標記山羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫反應2 h，凝膠成像系統曝光。本實驗重復3 次。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 對所得數據進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs 表面標志物的鑒定

BMSCs 表面標志物CD29、CD44、CD45 的陽性表達率分別為89.18%、87.65%、1.16%。見圖1。

圖1 骨髓間充質干細胞表面標志物

2.2 BMSCs 的成脂、成骨分化

BMSCs 油紅O 染色可見紅色脂滴，茜素紅染色可見橘紅色鈣結節。見圖2。

圖2 骨髓間充質干細胞成脂、成骨分化染色

2.3 不同比例BMSCs 與K562 細胞共培養不同時間的K562 細胞增殖率比較

BMSCs∶K562 細胞比例為1∶2、1∶1、2∶1 時，共培養各時間點的K562 細胞增殖率均低于同一時間點對照組，比例為2∶1 時各時間點的K562 細胞增殖率均低于同一時間點1∶2、1∶1（P ＜0.05）。BMSCs∶K562細胞比例為2∶1 時，共培養48 h 后K562 細胞增殖率均低于共培養24、72 h后（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 BMSCs 對K562 細胞增殖能力的影響（n=3）

2.4 兩組細胞衰老情況比較

BMSCs 組衰老細胞陽性率高于對照組（P ＜0.01）。見圖4。

圖4 BMSCs 對K562 細胞衰老的影響（n=3）

2.5 兩組p16INK4a 蛋白表達水平比較

BMSCs 組p16INK4a蛋白表達水平高于對照組（P ＜0.01）。見圖5。

圖5 兩組p16INK4a 蛋白表達水平比較（n=3）

2.6 兩組p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白表達水平比較

BMSCs 組p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白表達水平均低于對照組（P ＜0.01）。見圖6。

圖6 兩組p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白表達水平比較（n=3）

3 討論

BMSCs 是具有自我更新和多向分化能力的非造血祖細胞，是為成纖維細胞樣貼壁生長的細胞群體。在本研究分離的BMSCs 中，干細胞表面標志物CD29、CD44 陽性表達，造血干細胞表面標志物CD45 陰性表達，且其在體外成功分化為脂肪細胞和骨細胞，提示分離成功。

既往研究報道，臍帶MSCs 能抑制白血病細胞增殖并增強伊馬替尼誘導的K562 細胞凋亡[18-19]。健康小鼠BMSCs 注入白血病小鼠的骨髓中后，改善了局部骨髓微環境，改善血小板生成，減少了腫瘤負荷，并延長了白血病小鼠的生存期[20]。細胞增殖能力降低和SA-β-Gal 活性增高是衰老的常見表現。本研究中，BMSCs 與K562 細胞共培養后，K562 增殖率降低，SA-β-Gal 活性增高，提示BMSCs 能夠誘導K562 細胞衰老。p16INK4a是一種衰老調控分子，其高表達推動細胞進入衰老[21]。本研究中，BMSCs 組p16INK4a高于對照組，提示其能促進K562 細胞衰老。

Raf/MEK/ERK 信號級聯在細胞增殖、細胞周期等過程中發揮重要作用[22]。此信號通路在白血病BCRABL 融合基因形成后被異常激活[23-24]，導致K562 細胞大量增殖，靶向此通路的抑制劑能夠增強白血病化療效果[25]。本研究中，BMSCs 組Raf、MEK、ERK 活化蛋白表達量降低，提示BMSCs 發揮的抗衰老作用或許與該通路相關。目前與BMSCs 誘導腫瘤細胞衰老的報道較少，誘導腫瘤細胞衰老或許能減少腫瘤的復發，提供更長的生存期。現有研究停留在細胞階段，缺乏相關的體內實驗進行佐證，后續需深入研究BMSCs誘導腫瘤衰老的機制及影響，為臨床應用提供切實可靠的依據。